[發明專利]豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201210088026.7
• 申請日: 2012-03-30
• 公開（公告）號: CN102580079A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 魏戰勇;耿靜微;宋美榮;胡慧;王瑞寧;王亞賓;崔保安
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: A61K39/23
• 分類號: A61K39/23;A61K39/39;A61P31/20
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張紹琳

技術領域

本發明屬于豬細小病毒疫苗技術領域，具體涉及一種豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗及其制備方法。

背景技術

豬細小病毒病作為一種重要的母豬繁殖障礙疾病，對母豬和種豬的危害都很大，疫苗免疫預防是控制該病的主要手段。現在國內規模化豬場的存欄母豬及種豬場的種豬和后備種豬都需要進行該病的免疫預防接種。滅活疫苗作為預防PPV常用疫苗，具有安全、長效等很多優點，但存在常規白油佐劑疫苗免疫機體后不能產生較好的細胞免疫應答。常規鋁佐劑具有注射部位偶有紅疹、皮下結節、接觸性過敏等癥狀和增加易感個體的敏感性等缺點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是制備一種新型佐劑，提供一種豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗及其制備方法。

本發明的技術方案是：豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗，該疫苗由滅活的豬細小病毒病毒液與納米鋁佐劑以1:2的比例混合制成。

所述的豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗的制備方法，它的步驟如下：

（1）將豬細小病毒增值、純化、滅活；

（2）制備納米鋁佐劑，將氯化鋁溶于蒸餾水中，氯化鋁與蒸餾水的質量比為1:20-30，制成氯化鋁溶液，將質量濃度分數為25-28%的氨水滴入氯化鋁溶液中，調節pH為9.0，攪拌10-15分鐘，得到白色沉淀物，為氫氧化鋁膠，然后采用超速離心法收集氫氧化鋁膠沉淀，再用水洗，后轉移至錐形瓶中，加入蒸餾水制成懸浮液，蒸餾水的加入量為氯化鋁質量的10-15倍，在75-85℃下用磁力攪拌器不斷攪拌，用1?mol?/L?HCl調pH至3.0-4.0，反應持續8-10?h后得到透明的氫氧化鋁膠，最后，氫氧化鋁膠用雙蒸水透析純化24-28小時，將pH調至6.0，制成納米鋁膠佐劑；

（3）將滅活的豬細小病毒病毒液與納米鋁佐劑以1:2的比例混合，振蕩均勻，制成豬細小病毒納米鋁膠佐劑疫苗。

所述步驟（2）中的氯化鋁為六水結晶氯化鋁或無水氯化鋁。

本發明的有益效果是：本發明在乳鼠和豬體上對疫苗進行了安全性評價，結果發現，免疫之后無一只乳鼠死亡，無一頭仔豬發生致敏反應，同樣也未觀察到明顯的全身和局部反應，充分證明本發明滅活疫苗是安全、可靠的。本發明豬細小病毒納米鋁膠佐劑疫苗組在免疫第4周時CD4⁺/CD8⁺的比值顯著高于其他疫苗組，其比值由2.11提高到2.97，說明該疫苗加強了小鼠的細胞免疫狀態。本發明豬細小病毒納米鋁膠佐劑疫苗能誘導IFN-γ的分泌表達，該疫苗能顯著增強Th1型細胞產生免疫應答反應，誘導其分泌IFN-γ，從而增強細胞免疫水平，能產生較強的細胞免疫應答。

附圖說明

圖?1為PPV?滅活效果PCR檢測結果，M:.DNA?marker?DL2000；1.滅活16?h；2.?滅活20?h；3.?滅活24?h；4.滅活36?h；5.滅活48h；6.滅活72?h；

圖2為血清抗體水平的檢測結果；

圖3為免疫后小鼠外周血CD3+細胞所占百分比；

圖4為免疫后小鼠外周血CD3⁺?CD4⁺細胞所占百分比；

圖5為免疫后小鼠外周血CD3⁺CD8⁺細胞所占百分比；

圖6為免疫后小鼠外周血CD4+/CD8+的動態變化；

圖7為IL-4的標準曲線；

圖8為接種疫苗后小鼠血清中IL-4水平；

圖9為IFN-γ的標準曲線；

圖10為?免疫后小鼠血清中IFN-γ水平；

圖11為免疫后血清中HI抗體動態變化（log2）；

圖12為免疫后血清中ELISA抗體動態變化；

圖13為滅活苗免疫后豬外周血CD3+細胞所占百分比；

圖14為滅活苗免疫后豬外周血CD3⁺CD4⁺細胞所占百分比；

圖15為滅活苗免疫后豬外周血CD3⁺CD8⁺細胞所占百分比；

圖16為納米鋁膠佐劑的XRD表征圖。

具體實施方式

豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗，該疫苗由滅活的豬細小病毒病毒液與納米鋁佐劑以1:2的比例混合制成。

所述的豬細小病毒納米鋁膠佐劑滅活疫苗的制備方法，它的步驟如下：

（1）將豬細小病毒增值、純化、滅活；