[發(fā)明專利]一種耐低溫纖維素降解菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210087077.8
• 申請日: 2012-03-28
• 公開（公告）號: CN103361282A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李季;尚曉瑛;任莉;王莉瑛
• 申請（專利權(quán)）人: 北京沃土天地生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/42;C05F11/08;C05F17/00;C12R1/38
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域及生物降解領(lǐng)域，具體地說，涉及一種耐低溫纖維素降解菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

纖維素(cellulose)是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50％以上。麻、麥稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。常溫下，纖維素不溶于水及一般有機(jī)溶劑，如酒精、乙醚等；將其加熱到約150℃時仍不發(fā)生顯著變化，因此通常情況下，纖維素是比較穩(wěn)定的。

大量纖維素都存在于農(nóng)作物的秸稈中，但由于其難以分解，從而影響到它的利用推廣。我國農(nóng)作物秸稈具有分布廣、數(shù)量大等特點(diǎn)，如不合理充分利用這些資源，將會造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染。近年來，秸稈的利用方法有很多，但普遍存在著利用不充分、成本高等問題。因此利用現(xiàn)代生物技術(shù)處理農(nóng)作物秸稈將是秸稈利用的最佳途徑。

在低溫條件下，嗜溫微生物大多無法正常代謝，因此，尋找可在低溫環(huán)境中正常生存并可高效降解纖維素的菌種成為低溫環(huán)境農(nóng)作物秸稈利用的重點(diǎn)。低溫纖維素降解菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究具有很高的研究價值，意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對低溫環(huán)境下纖維素降解成本高、效率低的難題，提供一種能在低溫下生長并有效降解纖維素的菌種。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種耐低溫纖維素降解菌，其為假單胞菌屬(Pseudomonas?sp.)菌株B6-15，該菌分離自黑龍江省牡丹江市雙峰林場的腐殖土中。現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2012年3月7日，保藏號CGMCC?NO.5851。

經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到的菌株B6-15在瓊脂平板上的菌落呈圓形，淺黃色，直徑為2-3mm，表面較濕潤，中央較突起，邊緣整齊，不透明；單細(xì)胞呈短桿狀，革蘭氏陰性，無芽孢，有莢膜。

具體篩選方法為：取10g低溫環(huán)境中采集的樣品加入90mL無菌水中，充分振蕩后靜置，取10ml上清液接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在160r/min的搖床中，通過5℃、7℃、10℃的溫度梯度進(jìn)行馴化培養(yǎng)，以3d為一個周期。

篩選過程為：馴化培養(yǎng)一個周期后，取馴化后的菌液1mL，進(jìn)行梯度稀釋10^-5、10^-6、10^-7，取0.1mL平板涂布，在4℃下培養(yǎng)，選取菌落分布均勻的平板，挑取單菌落，分離純化后于4℃進(jìn)行保存。將純化菌株點(diǎn)接于纖維素分解菌篩選培養(yǎng)基平板上，經(jīng)過4℃培養(yǎng)后觀察在菌落周圍是否形成透明分解圈，測定記錄分解圈及菌落的直徑，作為選取耐低溫纖維素降解菌的依據(jù)。

纖維素水解酶的活性測定：用接種環(huán)挑取單菌落接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在15℃、160r/min條件下培養(yǎng)24h，取10ml接入90mL纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔24h取10mL經(jīng)過5000r/min離心5min后制成酶液，于4℃保存，然后用DNS法測定菌株的纖維素水解酶活力。

本發(fā)明還提供由上述耐低溫纖維素降解菌產(chǎn)生的纖維素酶。

本發(fā)明進(jìn)一步提供上述耐低溫纖維素降解菌在促進(jìn)堆肥升溫過程中的應(yīng)用，其是將假單胞菌屬B6-15接種到堆肥中，在環(huán)境溫度15～20℃下進(jìn)行快速升溫。

本發(fā)明篩選出的耐低溫纖維素降解菌可在低溫環(huán)境下(15～20℃)高效降解農(nóng)作物中纖維素，且成本低，易操作控制，為低溫環(huán)境下堆肥過程中纖維素的降解提供了新的微生物資源和技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1為篩選出的5株降解纖維素的菌株的纖維素水解酶活性比較。

圖2為假單胞菌屬B6-15的菌落形態(tài)(A)及顯微鏡下的形態(tài)(B)。

圖3本發(fā)明假單胞菌屬B6-15菌株的生長曲線。

圖4本發(fā)明假單胞菌屬B6-15菌株的堆肥升溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中為環(huán)境溫度，為對照組，即堆肥材料中未接入外來菌株B6-15，為實(shí)驗(yàn)組，即堆肥材料中接入菌株B6-15。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1耐低溫纖維素降解菌的分離

采集黑龍江省牡丹江市雙峰林場的腐殖土樣。將采集的樣品10g加到90mL無菌水中，充分振蕩后靜置取上清液加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，通過5℃、7℃、10℃的溫度梯度進(jìn)行馴化培養(yǎng)，3d為一個周期。