[發(fā)明專利]鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應用有效

申請?zhí)枺?/td>	201210086272.9	申請日：	2012-03-29
公開（公告）號：	CN102559939A	公開（公告）日：	2012-07-11
發(fā)明（設計）人：	孟繼鴻;江炳福;張建華;戴星	申請（專利權）人：	東南大學
主分類號：	C12Q1/70	分類號：	C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
代理公司：	南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200	代理人：	李紀昌
地址：	210096 ***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	鑒別 71 腸道病毒二重一步法 rt pcr 引物及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發(fā)明屬于病毒核酸檢測領域，涉及鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應用。

背景技術

手足口病（hand?foot?and?mouth?disease，HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，主要發(fā)生于3歲以下兒童，臨床表現(xiàn)為手、足、口腔等部位的皰疹。而引起手足口病的病原體有多種，如柯薩奇病毒A組的16、4、6、10、12，B組2、3、5，埃可病毒4、19、30，以及腸道病毒?71型（Enterovirus?71，EV71）等。其中以EV71和柯薩奇病毒A16（Coxsackievirus?16,?CA16）最為常見。通常情況下，EV71和CA16等非EV71感染引起的手足口病在臨床癥狀和體征方面難以區(qū)別，但EV71感染除了引起手足口病外，部分患者還能出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎樣的麻痹和神經(jīng)源性肺水腫等多種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，病情兇險，可嚴重危害嬰幼兒的生命健康，故倍受重視。近年來，我國及周邊地區(qū)手足口病疫情日趨嚴重。2011年我國全年累計報告的病例161萬余例，死亡509例。因此早期、快速、簡便、準確地鑒別EV71型和非EV71型手足口病，對于積極的臨床救治和疫情防控具有重要意義。

傳統(tǒng)的病原學診斷采用細胞培養(yǎng)分離和鑒定病毒的手段，耗時且操作復雜，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。分子生物學的進展開拓了腸道病毒的快速診斷技術，特別是PCR技術，由于其檢測材料用量少，快速，靈敏度高，特異性好，在病毒感染的診斷中發(fā)揮越來越多的重要作用。今RT-PCR技術已成為手足口病病原體快速診斷的重要手段，但目前建立的方法主要針對EV71和CA16，很容易造成其它病原體的漏診；且每個檢測都要單獨進行，繁瑣費時；若要檢測其他EV，還要再增加一個PCR反應管，試劑消耗大，操作步驟多，容易造成實驗失敗。如能建立一種單管二重一步法RT-PCR，鑒別EV71型和非EV71型手足口病，將具有廣泛的應用前景。

發(fā)明內容

解決的技術問題：本發(fā)明針對手足口病病原學檢查方法的單一性，耗時耗力的不足，提供一種高效、便捷的鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應用。

技術方案：

鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物，同時包括腸道病毒5’UTR通用引物和EV71?VP1基因特異性引物，所述腸道病毒5’UTR通用引物為：

引物F2：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’?；

引物R1：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’?；

所述EV71?VP1基因特異性引物為：

引物Fa：?5’-CCCAACACAGCYTAYATAATAGC-3’?；

引物Rb：5’-GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC?-3’；

其中R=A或G，W=?A或T，Y=C或T。

上述引物是在相應引物上從3’末端、從5’末端或者同時從3’和5’末端有1-5個附加核苷酸加入或缺失的引物。

上述引物在制備鑒別EV71型和非EV71型手足口病核酸檢測試劑中的應用。