[發(fā)明專利]鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210086272.9
• 申請(qǐng)日: 2012-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN102559939A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟繼鴻;江炳福;張建華;戴星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒核酸檢測(cè)領(lǐng)域，涉及鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應(yīng)用。

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背景技術(shù)

手足口病（hand?foot?and?mouth?disease，HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，主要發(fā)生于3歲以下兒童，臨床表現(xiàn)為手、足、口腔等部位的皰疹。而引起手足口病的病原體有多種，如柯薩奇病毒A組的16、4、6、10、12，B組2、3、5，埃可病毒4、19、30，以及腸道病毒?71型（Enterovirus?71，EV71）等。其中以EV71和柯薩奇病毒A16（Coxsackievirus?16,?CA16）最為常見。通常情況下，EV71和CA16等非EV71感染引起的手足口病在臨床癥狀和體征方面難以區(qū)別，但EV71感染除了引起手足口病外，部分患者還能出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹和神經(jīng)源性肺水腫等多種神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，病情兇險(xiǎn)，可嚴(yán)重危害嬰幼兒的生命健康，故倍受重視。近年來(lái)，我國(guó)及周邊地區(qū)手足口病疫情日趨嚴(yán)重。2011年我國(guó)全年累計(jì)報(bào)告的病例161萬(wàn)余例，死亡509例。因此早期、快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地鑒別EV71型和非EV71型手足口病，對(duì)于積極的臨床救治和疫情防控具有重要意義。

傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷采用細(xì)胞培養(yǎng)分離和鑒定病毒的手段，耗時(shí)且操作復(fù)雜，無(wú)法滿足病毒流行期間同時(shí)處理大量樣本的需要。分子生物學(xué)的進(jìn)展開拓了腸道病毒的快速診斷技術(shù)，特別是PCR技術(shù)，由于其檢測(cè)材料用量少，快速，靈敏度高，特異性好，在病毒感染的診斷中發(fā)揮越來(lái)越多的重要作用。今RT-PCR技術(shù)已成為手足口病病原體快速診斷的重要手段，但目前建立的方法主要針對(duì)EV71和CA16，很容易造成其它病原體的漏診；且每個(gè)檢測(cè)都要單獨(dú)進(jìn)行，繁瑣費(fèi)時(shí)；若要檢測(cè)其他EV，還要再增加一個(gè)PCR反應(yīng)管，試劑消耗大，操作步驟多，容易造成實(shí)驗(yàn)失敗。如能建立一種單管二重一步法RT-PCR，鑒別EV71型和非EV71型手足口病，將具有廣泛的應(yīng)用前景。

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發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明針對(duì)手足口病病原學(xué)檢查方法的單一性，耗時(shí)耗力的不足，提供一種高效、便捷的鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：

鑒別71型和非71型腸道病毒的單管二重一步法RT-PCR引物，同時(shí)包括腸道病毒5’UTR通用引物和EV71?VP1基因特異性引物，所述腸道病毒5’UTR通用引物為：

引物F2：5’-TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC-3’?；

引物R1：5’-ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3’?；

所述EV71?VP1基因特異性引物為：

引物Fa：?5’-CCCAACACAGCYTAYATAATAGC-3’?；

引物Rb：5’-GTAYCCAYGCCCTGACGTGYTTC?-3’；

其中R=A或G，W=?A或T，Y=C或T。

上述引物是在相應(yīng)引物上從3’末端、從5’末端或者同時(shí)從3’和5’末端有1-5個(gè)附加核苷酸加入或缺失的引物。

上述引物在制備鑒別EV71型和非EV71型手足口病核酸檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

從Genbank下載了世界各地的腸道病毒毒株，包含了腸道病毒所有67個(gè)血清型，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)：

依據(jù)腸道病毒5’UTR設(shè)計(jì)通用引物：

引物F1：5’-?AMCAAGCACTTCTGTTWCCCCGG?-3’??????23bp

引物F2：?5’-?TACTTCGAGAARCCTAGTAWCACC?-3’?????24bp

引物R1：5’-?ACGGACACCCAAAGTAGTCGGTTC?-3’?????24bp

引物R2：?5’-?CTYGATTGTCACCATAAGCAGCCA?-3’?????24bp；

?依據(jù)所有EV71病毒VP1基因設(shè)計(jì)特異性引物：

引物Fa：?5’-?CCCAACACAGCYTAYATAATAGC?-3’???????23bp

引物Fb：?5’-?CAGGGAGATAGRGTGGCRGATG?-3’???????22bp

引物Fc：?5’-?TGGRGCATCRTCRAATRCTAGTG?-3’???????23bp