[發(fā)明專利]一種GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210086010.2
• 申請(qǐng)日: 2012-03-28
• 公開（公告）號(hào): CN102633864A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐偉文;陳立勇;李明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C07K16/18;C07K16/06;G01N33/574
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種GPC3抗原多肽，抗GPC3的多克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3?(glypican-3,?GPC3)?是膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胎兒肝臟表達(dá)豐富，在成人肝臟不表達(dá)，于肝癌發(fā)生時(shí)常常再激活，是肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular?carcinoma,?HCC）發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要物質(zhì)，它不但在腫瘤組織中特異性高表達(dá)，同時(shí)也可在外周血中被檢測(cè)，其量的變化又與HCC病灶的存在與否、病情的嚴(yán)重程度密切關(guān)聯(lián)（可反映手術(shù)前后的狀態(tài)及治療效果，較AFP敏感）。尤其是，GPC3在AFP陰性肝癌中特異性表達(dá)，聯(lián)合檢測(cè)AFP和GPC3，可顯著提高HCC的診斷檢測(cè)率和準(zhǔn)確性，因此被認(rèn)為是一種極具潛能的新穎肝癌標(biāo)志物。免疫組化結(jié)果顯示，在70％～80％的肝細(xì)胞癌中可以檢測(cè)到GPC3過表達(dá)，而正常肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞均未見表達(dá)，癌旁組織不表達(dá)GPC3蛋白。陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈細(xì)顆粒狀。陽性細(xì)胞常簇集形成克隆樣區(qū)域，和陰性細(xì)胞形態(tài)明顯不同。假如癌旁組織中發(fā)現(xiàn)該蛋白表達(dá)，可能要考慮已有轉(zhuǎn)移性衛(wèi)星灶存在。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種肝癌標(biāo)志物GPC3抗原多肽。

本發(fā)明的另一目的是提供一種抗GPC3的多克隆抗體。

本發(fā)明的又一目的是提供上述抗GPC3的多克隆抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種GPC3抗原多肽，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，或在SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列C端連接一個(gè)半胱氨酸。在C端加入半胱氨酸是為了便于與載體蛋白偶聯(lián)。

一種抗GPC3的多克隆抗體，是以前述GPC3抗原多肽為免疫原，免疫動(dòng)物制備而成。

上述抗GPC3的多克隆抗體的制備方法，步驟如下：GPC3抗原多肽與馬來酰胺活化的匙孔血藍(lán)載體蛋白KLH偶聯(lián)，經(jīng)脫鹽純化后作為免疫原與佐劑混合免疫新西蘭兔，期間進(jìn)行兩次以上免疫，待ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)達(dá)1:8000后，采集兔血清，經(jīng)過純化、ELISA和western?blot鑒定后，得到抗GPC3的多克隆抗體。

化學(xué)合成的多肽抗原是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生很弱的免疫反應(yīng)，因而與載體蛋白交聯(lián)是很重要的。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T輔助細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)?B細(xì)胞反應(yīng)。用于與多肽交聯(lián)的載體蛋白有多種，其中最普遍使用的載體是匙孔血藍(lán)蛋白（keyhole?limpet?hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine?serum?albumin，BSA），卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲狀腺球蛋白（bovine?thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，與本發(fā)明的GPC3抗原多肽交聯(lián)后免疫原性最強(qiáng)，因此本發(fā)明選用KLH作為偶聯(lián)載體蛋白。BSA也常用來作為多肽載體，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測(cè)試驗(yàn)的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應(yīng)用上存在著一定的局限性。

GPC3的多克隆抗體在制備肝癌診斷試劑中的應(yīng)用，所述肝癌為肝細(xì)胞性肝癌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明對(duì)GPC3蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)、免疫原性、親疏水性、表面可及性等進(jìn)行分析，確定合適的一段肽序列進(jìn)行人工合成；將合成的多肽與馬來酰亞氨活化的載體mcKLH偶聯(lián)，將此偶聯(lián)產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽柱純化后免疫新西蘭兔；經(jīng)過多次免疫的兔血清用ELISA法對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)，效價(jià)達(dá)理想值后收集免疫兔血清，并用Protein?G蛋白純化柱純化抗體；對(duì)純化后抗體進(jìn)行ELISA、western?bot等鑒定。鑒定結(jié)果表明該多克隆抗體可特異性識(shí)別GPC3蛋白，可用于檢測(cè)肝癌細(xì)胞表達(dá)的GPC3蛋白，為肝癌診斷提供幫助，并能指導(dǎo)其臨床預(yù)后判斷和治療方案的選擇。

附圖說明

圖1.?經(jīng)DNAstar軟件分析GPC3免疫原性、親疏水性及表面可及性，方框中顯示的是選用合成的多肽序列片段。

圖2.?抗GPC3的多克隆抗體經(jīng)protein?G凝膠柱純化后的SDS-PAGE電泳(12%)檢測(cè)結(jié)果。泳道?1：蛋白Marker；泳道2：上樣峰；泳道3：流穿峰；泳道4：平衡峰；泳道5：洗脫上峰；泳道6：洗脫下峰。

圖3.?抗GPC3的多克隆抗體的western-blot鑒定結(jié)果，上樣為HepG2細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞系）裂解液。

具體實(shí)施方式