[發明專利]一種大豆高效遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201210085463.3
• 申請日: 2012-03-28
• 公開（公告）號: CN102618573A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 朱保葛;楊瑞;周國安;李素坤;潘毅
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種大豆高效遺傳轉化方法。

背景技術

大豆[Glycine?max(L)Merr.]是重要的經濟作物和油料作物，它的遺傳轉化研究一直受到學者們的廣泛關注，而主要瓶頸問題是轉化效率低。

現有的大豆遺傳轉化方法包括農桿菌介導法、電擊法、PEG轉化法、基因槍法、花粉管通道法等，比較成熟的是基因槍介導的體細胞胚轉化法和農桿菌介導的子葉節轉化法。

1988年Christou等首次將基因槍法應用于大豆愈傷組織的遺傳轉化，但未獲得再生植株，同年McCabe等利用基因槍法轉化大豆芽分生組織，獲得了轉基因植株，但大都為嵌合體。此后，基因槍轟擊法主要應用于大豆未成熟胚或體胚懸浮細胞系，能穩定獲得轉基因植株，但轉化效率都較低，而且存在再生植株周期長和轉基因植株敗育等缺點。

1998年Hinchee等首次報告了根癌農桿菌(Agrobacterium?tumfaciens)介導法成功轉化大豆的事例，后來不少學者采用這種方法進行大豆子葉節轉化研究，都獲得了轉基因植株，但轉化效率都比較低，而且嵌合體較多。

發明內容

本發明的目的是提供一種大豆高效遺傳轉化方法。

本發明提供了一種大豆高效遺傳轉化方法，依次包括如下步驟：

(1)通過基因槍轟擊法將含有目的DNA的質粒導入大豆外植體；

(2)通過農桿菌介導法將所述含有目的DNA的質粒導入完成步驟(1)的大豆外植體。

所述大豆外植體可為胚尖外植體，具體可為大豆成熟種子胚尖外植體(大豆萌動種子胚尖外植體)。

所述大豆成熟種子胚尖外植體的制備方法依次包括如下步驟：(1)將滅菌后的成熟大豆種子在無菌水中室溫浸泡24小時；(2)在無菌條件下去掉種皮，取下胚軸連同剛萌動的胚尖；(3)將下胚軸連同剛萌動的胚尖擺放在預培養培養基上，胚尖垂直向上，25℃-28℃培養24小時，然后去除原葉(葉原基，發育后形成真葉)，得到外植體(即大豆成熟種子胚尖外植體)；所述預培養的光照條件為16小時光照、光照強度150μmol?m^-2s^-1，8小時黑暗。

所述預培養培養基具體為含3.5mg/L?6-芐氨基嘌呤和30g/L蔗糖的MS-B₅固體培養基。

所述大豆具體可為K06-82大豆或科豐28號大豆。

所述基因槍轟擊法中，基因槍轟擊的參數具體可為：金粉直徑大小為1.0μm，真空度26～28英寸汞柱，氦氣壓力為1100psi，轟擊距離為6cm，每皿轟擊2次(第一次轟擊后平皿旋轉90°再轟擊第二次)，每次轟擊1μg所述含有目的DNA的質粒。具體可采用Bio-Rad?PDS1000/He基因槍。

所述農桿菌介導法具體可為：將完成步驟(1)的大豆外植體在重組農桿菌菌懸液中28℃黑暗條件下振蕩培養20小時；所述重組農桿菌是將所述含有目的DNA的質粒導入農桿菌得到的重組農桿菌。所述農桿菌具體可為農桿菌GV3101。所述重組農桿菌菌懸液具體可為OD_600nm＝0.45-0.5的菌懸液。所述重組農桿菌菌懸液具體可通過如下方法制備：將所述重組農桿菌重懸于培養基丁，得到重組農桿菌菌懸液。所述培養基丁為含6mg/L6-芐氨基嘌呤、200μM乙酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B₅液體培養基。乙酰丁香酮可以增加轉染效率。

以上任一所述方法均可用于制備轉基因大豆。

所述大豆具體可為K06-82大豆或科豐28號大豆。

本發明還保護一種制備轉基因大豆的方法，依次包括如下步驟：

(I)將出發大豆進行以上任一所述的遺傳轉化；

(II)依次進行共培養、恢復培養、篩選培養和生根培養，得到轉基因大豆。

所述大豆具體可為K06-82大豆或科豐28號大豆。

所述共培養具體可為在共培養培養基上，22℃暗培養4天。所述共培養培養基具體可為含6mg/L?6-芐氨基嘌呤、0.154g/L二硫蘇糖醇、0.2g/L?Na₂S₃O₃、1mg/L?AgNO₃、1g/LL-半胱氨酸、200μM乙酰丁香酮、30g/L蔗糖和10g/L葡萄糖的1/2MS-B₅固體培養基。乙酰丁香酮可以增加轉染效率。所述共培養培養基可以防止褐化和提高轉化效率。