[發明專利]一種松材線蟲人工飼養液的制備方法

在審

• 申請號: 201210085082.5
• 申請日: 2012-03-28
• 公開（公告）號: CN102613406A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 胡加付;黃小娟;蘇秀;郭愷
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: A23K1/18
• 分類號: A23K1/18;A23K1/14;A23K1/16
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于線蟲人工飼養技術領域，具體為一種松材線蟲人工飼養液的制備方法。

背景技術

松材線蟲Bursaphelenchus?xylophilus屬蠕形動物門，線蟲綱，墊刃目，滑刃總科，傘刃屬。線蟲成蟲蟲體細長，體長約1mm，雌蟲尾部近圓錐形，末端圓。雄蟲尾部似鳥爪，向腹面彎曲。松材線蟲病又稱松枯萎病，是一種毀滅性病害。國家林業局在2009年第3號公告,松材線蟲病疫區為江蘇、浙江、安徽、江西、山東、福建、湖北、湖南、廣東、重慶、云南、廣西、重慶、四川等15個省、區、市的193個縣(市、區)。據統計,?2008年全國松材線蟲病發生面積96.42萬畝,病死松樹106.17萬株。不僅直接破壞了自然景觀及生態環境,給國民經濟造成巨大損失,更對我國松林資源,尤其是對我國南方廣泛栽植的330多萬hm2松林和重要生態區域構成了嚴重威脅,同時,也嚴重地影響著我國外貿出口競爭力。根據植物病理學的經典柯赫氏法則,要對由松材線蟲引起的松材線蟲病進行研究,獲得松材線蟲的培養方法是整個研究的關鍵。因此,要對松材線蟲進行研究,首先就要獲得大量的線蟲。前人對松材線蟲的培養方法歸納起來主要有2大類3種方法:①單異活體培養——人工培養基培養松材線蟲,又分為2種,一種是用人工培養基先培養真菌,然后利用真菌培養;另一種則利用植物組織培養技術培養松樹愈傷組織,然后以松樹愈傷組織為食料培養。②無異活體培養——人工合成培養基直接培養松材線蟲。目前無菌松材線蟲的人工培養方法主要有單異活體培養和無異活體法,但也有學者指出:?這兩種方法的主要缺點是操作過程較為繁瑣,得到的無菌線蟲數量較少,難以滿足研究需要,食料真菌培養法其操作過程較為繁雜,易污染,難以排除食料真菌或消毒劑對實驗的影響;無異活體培養法其培養周期較長,產量較低,而且長期培養還可能會改變松材線蟲原有的生物學特性。在黑松愈傷組織上培養無菌松材線蟲既克服了食料真菌法的缺點,又較無異活體培養法所用培養周期短,產量要高;但是幾次繼代后的線蟲體型較小,保藏不方便。所以不管是單異活體培養還是無異活體法,建立一套科學完整的松材線蟲人工飼養體系,是以后松材線蟲人工培養的研究方向和關鍵。

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于設計提供一種松材線蟲人工飼養液的制備方法的技術方案，具有飼養成本低，操作簡便，應用范圍廣，線蟲產量高，同時不會改變松材線蟲原有的生物學特性。

所述的一種松材線蟲人工飼養液的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）按照松木屑15-20%、黃瓜15-20%、香蕉15-20%、蘋果15-20%、豌豆15-20%、麥芽糖15-20%的比例稱取上述物質，均粉碎至150-200目，備用；

2）將松木屑粉碎物用三層紗布包好放入盛滿清水的漏斗中，漏斗下接一段8-15?cm長的橡皮管，橡皮管上裝一個截流彈簧夾，13-17h后打開彈簧夾，用離心管接取橡皮管中水樣；靜置15-30?min，然后在轉速1500-2000r/min下離心2-5?min，除去離心管內上層清液后，即獲得濃度較高的松材線蟲懸浮液，備用；

3）將黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物加入水中浸泡3-5h，按照粉碎混合物1g加水量4-7ml的比例加水，用兩層紗布過濾除去殘渣，得到的濾液中再加入真菌，真菌的加入重量為粉碎混合物重量的0.08-0.2倍，充分攪拌均勻，26－30℃下靜置2-3h，然后取步驟1）中的松材線蟲懸浮液1-2滴，接種到上述飼養液中，即得松材線蟲人工飼養液。

所述的一種松材線蟲人工飼養液的制備方法，其特征在于步驟1）中：松木屑的含量為16-18%，黃瓜的含量為16-18%，香蕉的含量為16-18%，蘋果的含量為16-18%，豌豆的含量為16-18%，麥芽糖的含量為16-18%。

所述的一種松材線蟲人工飼養液的制備方法，其特征在于步驟2）中：橡皮管的長度為10-12?cm，截流彈簧夾夾住的時間為14-16h，靜置時間20-25?min，轉速1600-1800r/min，離心時間3-4?min。

所述的一種松材線蟲人工飼養液的制備方法，其特征在于步驟3）中：黃瓜、香蕉、蘋果、豌豆、麥芽糖粉碎混合物在水中浸泡時間3.5-4.5h。

所述的一種松材線蟲人工飼養液的制備方法，其特征在于步驟3）中：靜置溫度27－29℃，時間為2.2-2.8h。

所述的一種松材線蟲人工飼養液的制備方法，其特征在于步驟3）中所述的真菌為長喙殼菌、酵母菌、毛殼菌、鐮刀菌、灰葡萄胞菌中的一種或一種以上混合物。