[發(fā)明專利]一種人MMP-14抗原、相應(yīng)單克隆抗體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210083811.3
• 申請(qǐng)日: 2012-08-06
• 公開（公告）號(hào): CN102718840A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 杜軍;李翰;蔡紹暉;張革
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/08
• 分類號(hào): C07K7/08;C12N5/20;C12N15/06;C07K16/40;G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明;任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人MMP-14抗原、相應(yīng)單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular?matrix?ECM)對(duì)維持細(xì)胞生長分化所需要的環(huán)境起著重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶?(matrix?metalloproteinases,MMPs)是一個(gè)蛋白超家族，其依賴鋅離子而發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)作用。

在1962年Jerome?Gross和Charles?Lapiere在觀察蝌蚪尾巴蛻變過程中發(fā)現(xiàn)有一種酶能降解膠原酶，所以他們就把這種酶命名為膠原酶也就是MMP-1。目前在脊椎動(dòng)物共發(fā)現(xiàn)24種不同的基質(zhì)金屬蛋白酶，其中23種在人體中存在。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由5個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成：前肽區(qū)，催化域，鉸鏈區(qū)，類血紅素結(jié)合蛋白區(qū)。（1）疏水信號(hào)肽序列，主要作用是保持酶原的穩(wěn)定。當(dāng)該區(qū)域被外源性酶切斷后，MMPs酶原被激活;（3）催化活性區(qū)，有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)酶催化作用的發(fā)揮至關(guān)重要;（4）富含脯氨酸的鉸鏈區(qū);（5）羧基末端區(qū)，與酶的底物特異性有關(guān)。其中酶催化活性區(qū)和前肽區(qū)具有高度保守性。MMPs成員上述結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上各有特點(diǎn)。各種MMP間具有一定的底物特異性，但不是絕對(duì)的。同一種MMP可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份，而某一種細(xì)胞外基質(zhì)成分又可被多種MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。

基質(zhì)金屬蛋白酶幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分,破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，被認(rèn)為是該過程中主要的蛋白水解酶。其中MMP-14是與腫瘤侵襲關(guān)系最密切的酶，而且是在該蛋白酶家族中最具腫瘤特異性的蛋白。

MMP-14也稱膜型基質(zhì)金屬蛋白酶I（MT1-MMP），不但高表達(dá)于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞上，還高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上，具有以下特點(diǎn)：

（1）MMP-14在多種腫瘤組織中高表達(dá)：如乳腺癌，小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、食管癌、頭頸部腫瘤等，而在正常組織幾乎不表達(dá)；

（2）MMP-14與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)：MMP-14不僅可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)，而且可以通過切割MMP-2前體而激活MMP-2，活化的MMP-2是降解Ⅳ型膠原的主要酶，在腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移灶的形成以及瘤組織內(nèi)新生血管的形成中均起重要作用；

（3）MMP-14促進(jìn)腫瘤血管新生：MMP-14通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子VEGF，堿性成纖維細(xì)胞生長因子bFGF，以及通過與整合素aVβ3共同發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤血管生成。

（4）臨床證實(shí)MMP-14與腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)：如在乳腺癌患者中，MMP-14的表達(dá)水平越高，預(yù)后越差、腫瘤體積越大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移易常見。所以，以MMP-14作為腫瘤治療的靶分子，也具有適用于大多數(shù)實(shí)體腫瘤的通用性。

綜上所述，由于MMP-14在多種腫瘤組織中高表達(dá)并與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)等原因，開展對(duì)MMP-14的體外檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷及治療具有重要意義，MMP-14的單克隆抗原及抗體的成功研制對(duì)實(shí)現(xiàn)MMP-14的快速、準(zhǔn)確、特異性的檢測(cè)具有決定性的作用。目前，尚未見相關(guān)MMP-14的單克隆抗原及抗體等的技術(shù)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種人MMP-14抗原、相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞株及其單克隆抗體和應(yīng)用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種人MMP-14抗原，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示（氨基酸序列簡寫為：REVPYAYIREGHEKQA）。

一株雜交瘤細(xì)胞株92F11A，是由上述人MMP-14多肽制備得到的，于2011年8月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所），保藏編號(hào)CGMCC?No.5080。

上述雜交瘤細(xì)胞株92F11A的制備方法，步驟如下：

（1）用人MMP-14抗原與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)作為抗原免疫小鼠；

（2）取免疫后小鼠的脾臟細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合；

（3）融合細(xì)胞用ELISA法篩選陽性克隆，得到雜交瘤細(xì)胞株92F11A。

一種人MMP-14單克隆抗體，是由所述雜交瘤細(xì)胞株92F11A分泌所得的，能特異結(jié)合SEQ?ID?NO:1所示的抗原多肽，其抗體亞型為IgM型。