[發明專利]HLA-A0201限制性抗原特異性CTL制備方法

有效

• 申請號: 201210083796.2
• 申請日: 2012-03-26
• 公開（公告）號: CN102618498A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 時宏珍
• 申請（專利權）人: 時宏珍
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

1.HLA-A0201限制性抗原特異性CTL制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟：

a.CTL前體細胞來源細胞的富集與純化：

單采收集外周單個核細胞作為CTL前體細胞來源；采用臨床級陰性磁珠分離法，從收集外周單個核細胞中富集、純化CTL前體細胞即CD8+T淋巴細胞；

b.目標CTL誘導與第一輪擴增：

用負載HLA-A0201限制性目標抗原多肽的成熟樹突狀細胞刺激CD8+T淋巴細胞，同時加入rhIL-2和rhIL-7兩種細胞因子聯合促進T細胞生長；第二周再重復刺激一次，完成第一輪擴增；

c.目標CTL純化方法：

采用Tetramer標記方法和流式細胞分選術純化目標CTL，即選擇Tetramer+CD8+T淋巴細胞；

d.目標CTL第二輪擴增：

采用固相包被的anti-human-CD3mAb和IL-2刺激目標CTL的生長；加入經γ射線輻照后的自體外周單個核細胞增強對目標CTL的活化；加入rhIL-15繼續培育，完成第二輪擴增，收集鑒定。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中目標抗原為已知的具有明確抗原表位和HLA-A0201限制性的腫瘤或病毒抗原多肽，多肽長度為9-15個氨基酸。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于目標抗原為Her2-neu抗原多肽、AFP抗原多肽、CEA抗原多肽、PSA抗原多肽、HBV抗原多肽、EBV抗原多肽或HPV抗原多肽。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟b中負載目標抗原的自體成熟DC是通過下列方法制備得到的：將外周單個核細胞貼壁后加入含rhGM-CSF、rhIFNα、滅活的混合正常人AB血清和RPMI1640培養基培養三天，收獲DC再加入目標抗原孵育即得。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟c中用于目標CTL擴增的γ射線輻照的自體外周單個核細胞是通過下列方法制備得到的：留取部分權利1中單采獲得外周單個核細胞，經30-50GY的γ射線輻照后保存；保存液：含20％(V/V)DMSO和20％(V/V)正常人AB血清的RPMI1640培養液，保存溫度：-80℃超低溫保存。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟d中用于目標CTL擴增的CD3單抗克隆抗體(CD3-mAb)是如下操作的：將CD3單抗固相包被于用于擴增細胞的容器表面，CD3-mAb可與多個CTL表面的CD3分子結合，促進CTL細胞克隆的形成，促進細胞接觸，快速進入增殖周期。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于目標CTL是指表達識別特定抗原多肽TCR的CD8+T，即Tetramer+CD8+T淋巴細胞。

8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于各步驟中刺激分子或細胞的初始加入量分別為：

a.目標CTL第一輪擴增：rhIL-2終濃度為500-1000IU/ml，rhIL-7終濃度為50-100ng/ml，DC與起始CD8+T細胞數量比為1∶5。

b.目標CTL第二輪擴增：rhIL-2終濃度為250-500IU/ml，rhIL-15終濃度為100-250ng/ml，CD3單克隆抗體包被濃度為1.0-3.0μg/ml，γ射線輻照的外周單個核細胞與起始CTL數量比為2∶1。

9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于各步驟操作后細胞數量與表型特征分別為：