[發(fā)明專利]甲型副傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)用引物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210083681.3
• 申請(qǐng)日: 2012-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN102634577A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆梅英;樊粉霞;闞飆
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及甲型副傷寒沙門菌的檢測(cè)，具體地說，涉及甲型副傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)用引物。

背景技術(shù)

甲型副傷寒沙門菌(S.Paratyphi?A)是腸道傳染病中最常見的病原菌之一，對(duì)甲型副傷寒沙門菌的快速、準(zhǔn)確檢定是控制甲型副傷寒流行的重要手段。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷甲型副傷寒的主要方法為細(xì)菌培養(yǎng)、肥達(dá)氏凝集反應(yīng)、傷寒血球快速診斷方法。這些方法仍存在著陽性率相對(duì)較低，誘導(dǎo)H-a抗原費(fèi)時(shí)，不利于早期診斷等缺陷，給流行病學(xué)追蹤、早期控制及臨床早期診斷工作帶來一定難度，因此，有必要建立甲型副傷寒沙門菌的快速、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供甲型副傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)用引物。

本發(fā)明的另一目的是提供含有所述逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR引物的用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種甲型副傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)用引物，其包括：

正向引物：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’和

反向引物：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’。

本發(fā)明進(jìn)一步提供含有上述引物的用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門菌的試劑盒。

本發(fā)明針對(duì)甲型副傷寒沙門菌hsdM基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立檢測(cè)該靶基因的逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR方法，利用35個(gè)血清型的純培養(yǎng)甲型副傷寒和非傷寒沙門菌菌株、常見非沙門致腹瀉病原菌以及發(fā)熱為主要癥狀的8種常見病原菌RNA來評(píng)價(jià)該方法的特異性及敏感性，同時(shí)對(duì)甲型副傷寒沙門菌全血模擬標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)下限確定。結(jié)果表明，利用該方法檢測(cè)44株甲型副傷寒沙門菌均呈陽性，其余34種非傷寒沙門菌血清型、致腹瀉的其他5種腸道致病菌以及發(fā)熱為主要癥狀的8種常見非沙門菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說明該方法的特異性、敏感性均較高，達(dá)100％。在對(duì)純菌總RNA檢測(cè)中，逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR的最低檢測(cè)限為5pg/反應(yīng)，約為1900個(gè)拷貝/反應(yīng)。在以全血模擬樣品提取核酸為模板的檢測(cè)中，最低檢測(cè)限達(dá)40cfu/mL。

附圖說明

圖1為本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖；其中，1為陰性對(duì)照，2為傷寒沙門菌樣品，3為乙型副傷寒沙門菌，4為丙型副傷寒沙門菌，5為鼠傷寒沙門菌，6為腸炎沙門菌，7-29為甲型副傷寒沙門菌樣品，30為甲型副傷寒沙門菌陽性對(duì)照，M為DNA分子量Marker。

圖2為本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)純菌RNA擴(kuò)增曲線圖；其中，a～h對(duì)應(yīng)的模板濃度為，a：0.5×10⁷pg/反應(yīng)；b：0.5×10⁶pg/反應(yīng)；c：0.5×10⁵pg/反應(yīng)；d：0.5×10⁴pg/反應(yīng)；e：0.5×10³pg/反應(yīng)；f：0.5×10²pg/反應(yīng)；g：0.5×10¹pg/反應(yīng)；h：0.5pg/反應(yīng)；NC：陰性對(duì)照。

圖3為本發(fā)明逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)血模擬標(biāo)本擴(kuò)增曲線圖；其中，a為陽性對(duì)照，b～g對(duì)應(yīng)的模板濃度為，b：7×10⁵cfu/ml；c：7×10⁴cfu/ml；d：7×10³cfu/ml；e：7×10²cfu/ml；f：7×10cfu/ml；g：7×10⁰cfu/ml；NC：陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例甲型副傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR檢測(cè)用引物的設(shè)計(jì)及檢測(cè)方法

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用菌株

本實(shí)施例中使用的甲型副傷寒沙門菌44株，傷寒沙門菌、乙型和丙型副傷寒沙門菌以及其他31種非傷寒沙門菌血清型共57株(表1)，所有血清型均使用沙門菌抗血清(購自Statens?Serum?Institut，SSI，丹麥)進(jìn)行血清型鑒定。另外，其他腸道常見病原菌及引起發(fā)熱并可在血液標(biāo)本中分離到的肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團(tuán)菌、腦膜炎奈瑟菌、立克次體、布魯氏菌等菌株(表1)用于特異性及敏感性評(píng)價(jià)，上述菌株均來自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。

1.2引物設(shè)計(jì)