[發(fā)明專利]殺菌肽LL-37的基因工程的表達(dá)及其制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210083101.0
• 申請(qǐng)日: 2012-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103361341A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳曉琰;陸怡;龔鐵軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吳曉琰;陸怡;龔鐵軍
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/00;A61K38/16;A61P31/04;A61P31/10
• 代理公司: 上海市華誠(chéng)律師事務(wù)所 31210
• 代理人: 李平

1.一種殺菌肽LL-37的基因工程的表達(dá)方法，包括合成編碼殺菌肽LL-37的DNA序列，連接到表達(dá)載體：GST載體或pUC18載體或pEZZ載體，在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌JM109中進(jìn)行表達(dá)和純化，其中LL-37基因工程菌的表達(dá)載體中的單鏈DNA結(jié)構(gòu)SEQ?ID：

-CTG-CTG-GGT-GAT-TTC-TTC-CGT-AAA-AGC-AAA-GAA-AAA-ATC-GGT-AAA-GAA-TTC-AAA-CGT-ATC-GTT-CAG-CGT-ATC-AAA-GAT-TTC-CTG-CGT-AAC-CTG-GTT-CCG-CGT-ACC-GAA-AGC。

2.如權(quán)利要求1所述的殺菌肽LL-37的基因工程的表達(dá)方法，其中所述的殺菌肽LL-37還包括藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。

3.如權(quán)利要求2所述的殺菌肽LL-37的基因工程的表達(dá)方法，其中所述的載體是DDH20或生理鹽水。

4.如權(quán)利要求2所述的殺菌肽LL-37的基因工程的表達(dá)方法，其中所述的輔料是異丙醇及丙二醇或γ-多聚谷氨酸。

5.一種殺菌肽LL-37的基因工程制備方法，包括基因重組、重組融合蛋白的獲得純化和切斷，目的多肽的純化，其步驟如下：

(1)為合成基因工程菌LL-37，用化學(xué)合成的方法合成編碼LL-37的DNA序列連接在載體蛋白上，之間以大腸桿菌偏愛(ài)的甲硫氨酸Methionine的DNA密碼子ATG連接；

(2)為合成基因工程菌LL-37，將載體蛋白-Methionine-LL-37的DNA序列插入Lac質(zhì)粒載體；

(3)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109進(jìn)行表達(dá)，得到基因工程菌殺菌肽LL-37菌株；

(4)將菌株置于營(yíng)養(yǎng)豐富的LB培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間為12-24小時(shí)，發(fā)酵液中加入氨芐西林使其最后濃度為50μg/ml，以及IPTG，終濃度為0.5mM，發(fā)酵結(jié)束后離心獲得菌體，經(jīng)細(xì)胞粉碎，包涵體復(fù)性，融合蛋白的分離純化；

(5)凍干后融合蛋白加入70％甲酸反應(yīng)體系(蛋白濃度1mg/ml)，通氮?dú)?小時(shí)后，加入溴化氰的乙腈溶液，W溴化氰/W融合蛋白＝100∶1，W溴化氰/V乙腈＝1g∶1ml，封瓶后黑暗中磁力攪拌7天，加入2N氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH5-6，溶液呈無(wú)色，終止反應(yīng)，2000分子量透析過(guò)夜，凍干除去溴化氰，加60％乙腈溶解，制備RP-HPLC?C18柱(φ30X300mm，Agilent，USA)。線性梯度20-80％乙腈，含0.1％三氟乙酸，30ml/min?30分鐘一個(gè)周期。220nm的每個(gè)峰均進(jìn)行小肽蛋白電泳分析。收取目的多肽。旋蒸后凍干，獲得重組LL-37粉末，純度＞90％；

(6)殺菌肽LL-37粉末溶于載體或輔料形成藥品用于治療。

6.如權(quán)利要求5所述的殺菌肽LL-37的基因工程制備方法，殺菌肽LL-37形成藥品用于治療皮膚感染。