[發(fā)明專利]中國南海信號芋螺毒素Lt7b的制備及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210082809.4
• 申請日: 2012-03-23
• 公開（公告）號: CN102628048A
• 公開（公告）日: 2012-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐安龍;吳赟;王磊;任政華;周茂軍;尤馭文;朱曉燕;強媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;C12N15/63;C12N15/70;C12Q1/02;A61K38/17;A61P29/00
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 華輝;劉菁菁

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種多肽及其編碼基因序列、其制備方法和應(yīng)用。屬于生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)

芋螺(Cone?snails)，俗稱為“雞心螺”，其在分類學(xué)上隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、新腹足目(Neogastropoda)、芋螺科(Conidae)、芋螺屬(Conus)。地球上現(xiàn)存的芋螺物種約有700多種，主要分布于溫暖的熱帶或亞熱帶海域，其中以印度-太平洋區(qū)域和東太平洋-西大西洋區(qū)域最多。芋螺一般生活在巖石、珊瑚礁、沙和泥沙質(zhì)的海底。少數(shù)物種可以棲息在幾十米至200余米的深水區(qū)。白晝或退潮后在海藻下或珊瑚洞中棲息，夜晚外出覓食，春季和夏季為其主要的繁殖期。我國現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)了約有80多種芋螺，主要分布于南沙群島、西沙群島、海南島及臺灣附近海域，少數(shù)分布在廣東、廣西沿海。

芋螺按其食性可分為三大類：食魚芋螺(piscivorous)，食螺芋螺(molluscivorous)和食蟲芋螺(vermivorous)。其中食蟲性芋螺種類最多，占全部芋螺種類的70％左右，而食魚性芋螺雖然占芋螺總數(shù)較少，但毒性最強，至今為止報道的芋螺致死事件基本上是該類芋螺造成的。

芋螺的毒液是其捕食、防御和競爭的主要武器。毒液由芋螺毒管的上皮細胞分泌產(chǎn)生，并儲存于毒管末端的毒泡中。毒液的主要活性成分是復(fù)雜的雞尾酒樣的混合毒素多肽，即芋螺毒素(conotoxin)。每種芋螺個體的毒液中大約含有100-1000種成分，其中的絕大部分都是芋螺毒素。

近幾十年來的研究表明，芋螺毒素主要作用于細胞膜上各種離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)/激肽的受體，且具有很強的生物學(xué)活性。芋螺毒素具有如下特點：分子質(zhì)量小，富含二硫鍵；前導(dǎo)肽高度保守而成熟肽具有多樣性；作用靶點廣且具有高度組織選擇性。芋螺毒素常被作為探針用于各種離子通道和受體的類型及亞型的分類和鑒定，也極有望直接開發(fā)成藥物或作為先導(dǎo)化合物用于新藥的研發(fā)。

目前，國內(nèi)外已明確功能的芋螺毒素只占了整個毒素庫的很小一部分，但是對它們的生理功能已經(jīng)有了較為清晰的認識。芋螺毒素二硫鍵骨架和結(jié)構(gòu)的不同，決定了它們功能靶位的差異，已經(jīng)清楚的靶位主要包括配體門控的離子通道、電壓門控的離子通道及G蛋白偶聯(lián)的受體。

二十世紀七十年代，美國猶他大學(xué)教授B.M.Olivera的實驗室最早開始了對芋螺毒素全面系統(tǒng)研究工作。芋螺毒素按照其結(jié)構(gòu)特點(前體肽中N端高度保守的信號肽區(qū)和C端的二硫鍵骨架)，可分為不同的超家族和骨架類型。至今已經(jīng)得到分離的芋螺毒素有數(shù)千種，數(shù)十種芋螺毒素已申請美國專利。它們在鎮(zhèn)痛、局部缺血性保護、癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價值，有的已進入臨床研究或已被FDA正式批準為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥。目前，由Elan公司進行開發(fā)的芋螺毒素ω-MVIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神經(jīng)組織的N-型鈣離子通道，無需第二信使或蛋白，不成癮，已成為治療難治性神經(jīng)疼痛的新一代藥物，已通過了III期臨床試驗，正式被FDA批準上市。而另一個衍生于ω-芋螺毒素CVID的化合物AM336作用類似于Ziconotide，因其對N-鈣通道的選擇性更強，副作用更低，已經(jīng)批準作為對抗嚴重抗嗎啡作用慢性疼痛的治療藥物進入臨床試驗階段。此外，Conantokin-G作為NMDA受體高度選擇性的拮抗劑，對難以治療的癲癇有效，也已完成I期臨床試驗。

另一方面，芋螺毒素作為研究離子通道和膜受體的極好探針或工具，已經(jīng)成為電壓門控型鈣離子通道(VSCCs)和N型乙酰膽堿受體(nAChRs)等通道、受體鑒定和診斷的標準工具，在神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種中國南海信號芋螺毒素基因Lt7.2，其基因序列如序列表中序列1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述信號芋螺毒素基因Lt7.2編碼的多肽Lt7b，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種重組表達載體pTRX-Lt7.2。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種多肽的表達方法，從表達、分離和純化幾個方面對原有的多肽表達方法進行改良。

本發(fā)明的第五個目的在于提供上述芋螺毒素多肽Lt7b在神經(jīng)生物學(xué)研究及鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)中的應(yīng)用。

本發(fā)明使用的信號芋螺采自中國海南省三亞市。

本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫和測序的方法，從中國南海信號芋螺毒管中分離得到中國南海信號芋螺毒素基因Lt7.2。