[發明專利]一種重金屬鎘抗性相關蛋白DbsCzcA及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201210079831.3
• 申請日: 2012-03-22
• 公開（公告）號: CN102603873A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 陳亮;謝麗娟;許光遠;俞陸軍;胡敏;廖斌;束文圣
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/11;C12N15/63;C12N1/21;C02F3/00;B09C1/00;C12R1/19;C02F101/22
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明屬于微生物基因工程，和生物修復領域。具體地說，本發明提供了生活在酸性礦山廢水(acid?mining?drainage，AMD)的一種未知微生物所含有的一種對重金屬鎘抗性的基因即陽離子外排系統蛋白基因(DbsCzcA)的序列，以及該序列推測編碼蛋白質分子的氨基酸序列。本發明在提高微生物和植物對重金屬鎘的抗性方面有著重大的應用價值。

背景技術

隨著礦產資源的開發利用、工業發展，重金屬對環境造成的污染日趨嚴重，土壤重金屬污染已經成為一個危害全球環境質量的問題。土壤重金屬會影響植物的生長發育，降低農作物的產量和質量，帶來了嚴重的經濟損失。此外，受土壤重金屬污染的作物在植物體中積累，并通過食物鏈富集到人體和動物體中，危害人畜健康，引發癌癥和其他疾病等。治理重金屬污染刻不容緩，各種修復技術和措施正在研究和應用中。各國政府和科學家著力通過兩個途徑解決這一問題：一為利用物理的，化學的方法試圖清除土壤或水體的重金屬污染：二為利用現代生物技術清除污染。自從20世紀80年代以來，生物修復技術因其具有處理費用低、對環境影響小、效率高等優點，越來越受到廣大科技人員的廣泛關注。生物修復一般分為植物修復、動物修復和微生物修復三種類型，其中植物修復和微生物修復是研究的熱點。微生物修復就是利用微生物將環境中的污染物降解或轉化為其他無害物質的過程。近年來，基于微生物對重金屬的作用機理，以修復有毒有害金屬污染或回收有經濟價值重金屬為目的的生物處理技術日趨成熟。植物修復指利用植物去治理水體、土壤和底泥等介質中的污染的技術。然而用于重金屬污染修復的生物往往會受到重金屬的毒害，生長緩慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金屬對植物和微生物的毒害作用是生物修復的主要限制因素。

解決生物修復中重金屬對生物的毒害作用的根本途徑在于研究耐受重金屬的分子生物學機制，克隆對重金屬耐受的關鍵基因，通過基因工程手段獲得用于生物修復中性能優良的轉基因工程生物。

由于技術上的原因，直到最近，對微生物基因資源的利用主要局限于可培養微生物。然而，已培養微生物僅占自然界中微生物的不到1％，因此各種生境中的微生物宏基因組是一個巨大而未發掘的基因資源庫。極端環境具有豐富的微生物資源，當中許多與逆境和關鍵生命過程相關的基因在長期的適應進化中獲得了更強的耐性潛能，發掘這些抗性基因已成為國際重要的研究熱點。酸性礦山廢水(AMD)是極端生境微生物學研究的重要系統。AMD來源于采礦活動使含硫礦物(主要為黃鐵礦，FeS₂)暴露于空氣和水中，在微生物催化作用下迅速氧化產酸所致，其pH值一般在1-4左右，而且富含硫酸鹽以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金屬，是采礦業面臨的最嚴重環境問題之一。在AMD中生存的原核微生物在長期的進化過程中逐漸形成了一些獨特機制，以應對低pH值、高鹽度以及高重金屬等多種極端環境協迫。因此，AMD生境成為極具特色和豐富的抗逆基因庫。

鎘(Cd)是一種極其重要的工業和環境化學污染物，因其對環境水、空氣和土壤的污染而在動植物體內蓄積，最終導致對人類健康的危害，并由于它在體內能長期蓄積，不易排除，故易產生慢性的和遠期的病理效應，可損傷許多組織和系統。把生物體內的鎘離子快速排出是一種有效的解毒方式。

Czc是一種膜結合的蛋白復合體，它通過主動運輸把細胞內的Co²⁺，Zn²⁺和Cd²⁺排出到細胞外，從而解除這些重金屬離子的毒性。在這個蛋白復合體中，CzcA編碼一個陽離子/質子對流泵，CzcB編碼一個亞基與陽離子結合，CzcB主要與Zn2+結合，CzcC與CzcB結合，使CzcB構象發生改變，能與Co²⁺和Cd²⁺結合。，CzcD、CzcE、CzcS和CzcR編碼四個CzcCBA操縱子，對Czc復合體起著調控的作用。但CzcD、CzcE、CzcS和CzcR對這個Czc蛋白復合體的表達并不是必需的。

Nies等發現CzcR?and?CzcD影響Alcaligenes?eutrophus通過Czc重金屬外排系統對鈷，鋅，鎘的抗性。Legatzki研究表明Ralstonia?metallidurans的Czc系統與另外兩個P型ATP酶相互影響，對提高它對重金屬的抵抗力都有一定的作用。在Ralstonia?metallidurans中czcNp啟動子控制著Czc復合體的表達，從而決定著它對重金屬的抵抗能力。

發明內容