[發明專利]人輪狀病毒毒種ZTR-68毒株及其分離，培養與鑒定

有效

• 申請號: 201210077653.0
• 申請日: 2012-03-22
• 公開（公告）號: CN102618505A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 李泓鈞;孫茂盛;易山;張光明;吳晉元
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/08;G01N33/569;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 昆明祥和知識產權代理有限公司 53114
• 代理人: 董昆生

1.一種人輪狀病毒毒種毒株，其特征在于該毒株為輪狀病毒（Rotavirus?A）ZTR-68毒株，于2011年09月22日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）提交保藏，編號：CGMCC?No.?5265。

2.如權利要求1所述的人輪狀病毒毒種ZTR-68毒株的分離方法，其特征在于具體如下：

（1）獲取病毒樣本

收集醫院兒科一腹瀉病患幼兒腹瀉排泄物標本，重懸于0.01?M?PBS，pH?7.2溶液中，12000?g離心20分鐘取上清液，并使用0.22?μm濾器除菌過濾，-20℃保存備用；

（2）ZTR-68毒株病毒在MA104細胞上的適應

采用0.25%胰酶-EDTA消化已形成單層的P?29?代MA104細胞，待細胞經消化形成單個后，以DEME-8%?BCS重懸細胞，稀釋至10^5.0細胞/ml，按2×10^5.0細胞/瓶接種小方瓶，37℃培養3～4天后，將輪狀病毒感染的患兒腹瀉樣本稀釋液200?μl接種于細胞單層，37℃吸附2小時，隨后加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37℃培養并觀察細胞病變，至3～4天出現細胞病變后，收獲培養物后繼續同法接種MA104細胞傳代或凍存備用。

3.如權利要求1所述的人輪狀病毒毒種ZTR-68毒株的培養方法，其特征在于具體如下：

（1）ZTR-68毒株病毒在Vero細胞上的適應：

采用0.25%胰酶-0.01%EDTA消化已形成單層的P?136代Vero細胞，并以DMEM-8%BCS重懸細胞，按10^5.0細胞/瓶接種小方瓶，37℃培養3～4天至形成致密細胞單層后，接種原MA104細胞收獲的病毒液1?ml，接種量約為10^4.0～10^5.5?CCID₅₀/ml，37℃吸附2小時，隨后加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37℃培養并觀察細胞病變，收獲培養物后繼續同法接種Vero細胞傳代或凍存備用；

（2）病毒毒株ZTR-68的克隆純化：

在Vero細胞上已適應傳代到第7代次的輪狀病毒收獲液，稀釋至10^-3、10^-4、10^-5三個稀釋度，接種于已形成單層的Vero細胞六孔培養板，37℃吸附2小時，加入不含小牛血清的DMEM維持液，48小時后去除培養液，加入含0.8%瓊脂糖-DMEM，待瓊脂固化后，反置培養于37℃，3天后于鏡下觀察蝕斑形成，用巴氏管吸取出蝕斑，置于1.5?ml離心管，加入0.5?ml?DMEM維持液，漩渦振蕩至均勻，隨即接種于Vero細胞單層，37℃培養3～4天，待細胞病變后收獲病毒，收獲病毒繼續接種于Vero細胞生長傳代。

4.如權利要求1所述的人輪狀病毒毒種ZTR-68毒株的鑒定方法，其特征在于具體如下：

（1）ZTR-68毒株病毒滴度測定：

取毒種10倍系列稀釋，接種MA104單層細胞進行病毒FFA滴定，按10^4.0細胞/100?μl/孔?加入MA104細胞，37℃培養3～4天細胞生長為致密單層，加入10倍系列稀釋的毒種，每個稀釋度10個孔，37℃吸附2小時后加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37℃培養16小時，采用50%?甲醛溶液4℃固定細胞板2小時，洗凈甲醛，隨后加入含1：500稀釋由中國醫學科學院醫學生物學研究所制備的抗輪狀病毒豚鼠血清的5%BSA-PBS?pH?7.2?溶液，37℃培養1小時，洗板后加入含1：2000稀釋的Millipore公司制造的羊抗豚鼠FITC抗體的5%?BSA-PBS?pH?7.2?溶液，37℃培養1小時，洗板后在熒光顯微鏡下判定結果，結果計算按Reed-Muench?Method公式計算：????????????????????????????????????????????????，Log?ID₅₀（FFA）=?(log?dilution?above?50%)?+?(Proportionate?distance?×?log?dilution?factor)；

（2）ZTR-68毒株病毒中和鑒別實驗：

將分離毒株病毒抗血清按梯度稀釋后，100?μl/孔接入96孔平底組織培養板，加入梯度稀釋的收獲病毒，37℃?CO₂孵箱中和1小時后，按104細胞/100?μl/孔加入經消化懸浮的Vero細胞，37℃?CO₂孵箱中培養8～10天，觀察結果；

（3）ZTR-68毒株病毒基因組核酸及逆轉錄、cDNA質粒構建：

病毒基因組的核酸提取按TAKARA?MiniBEST?病毒基因組RNA提取試劑盒操作手冊進行，病毒基因RNA逆轉錄使用TAKARA?OneStep?RT-PCR試劑盒，按操作手冊進行，并根據A組輪狀病毒G1型基因型全基因序列設計合成針對11個RNA片段的11對引物，并分段以RT-PCR方法獲得11個cDNA基因片段，克隆入pMD19-T載體中，逐一進行測序；

（4）不同代次ZTR-68毒株病毒基因組穩定性及序列比較：

病毒通過在Vero細胞傳代培養，收獲P1代次至P10代次的病毒收獲液，病毒基因組的核酸提取按TAKARA?MiniBEST?病毒基因組RNA提取試劑盒操作手冊進行，非變性PAGE凝膠電泳11小時，硝酸銀染顯色后于凝膠成像儀記錄圖像，根據輪狀病毒基因序列設計合成針對VP4基因和VP7基因的2對引物，病毒基因RNA逆轉錄使用TAKARA?OneStep?RT-PCR試劑盒，按操作手冊進行，通過克隆測序后，使用MEGA軟件對不同代次的病毒VP4和VP7基因序列進行比較，其基準序列使用本實驗室對該分離毒株接種Vero傳代至第2代所獲取的基因，共比較1～10代病毒的VP4和VP7基因序列。