[發明專利]褐牛蜘蛛腿綜合征致病位點PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201210076915.1
• 申請日: 2012-03-21
• 公開（公告）號: CN102586464A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 王雅春;初芹;焦士會;俞英;張勝利;孫東曉;張毅;張沅
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種褐牛疾病的分子檢測方法。

背景技術

家畜遺傳疾病(Animal?genetic?disease)是指由遺傳物質變異對家畜個體造成有害影響，表現為身體結構缺陷或功能障礙，這種有害的遺傳信息按一定的遺傳方式在世代間垂直傳遞，在某些品種的家系內呈現一定的表達方式，不會延伸到無親緣關系的個體(張沅，2001)。動物遺傳疾病的爆發給畜牧育種和生產者造成巨大經濟損失。由于奶牛和肉牛AI繁育體系的建立，種公牛的優秀生產性能基因在全群內的推廣傳播效率越來越高，對全群奶牛的生產性能改良起到巨大的推動作用。奶牛和肉牛遺傳種質資源(包括優秀個體、公牛凍精、優質胚胎)世界范圍內交換的日益頻繁，也加速了有害基因在世界牛群范圍內的傳播擴散。

牛蜘蛛腿綜合征(Arachnomelia?Syndrome，AS；OMIA?pheneID139，Group?000059)是一種先天性致死性骨骼畸形遺傳病，患病個體出生時或出生不久后死亡。該病最早是于1975年，由德國科學家Rieck和Schade報道的，現除了個別在荷斯坦牛群中散發的患病牛外，該病主要存在于德系西門塔爾牛和瑞士褐牛群體中。雖然在兩個品種中，AS癥狀相似，但遺傳基礎并不相同。在西門塔爾牛群中，該病是由MOCS1基因外顯子11的缺失突變c.1224?1225delCA引起的，該突變將造成移碼突變產生不成熟的短鏈蛋白，突變位點發生在一個該蛋白質物種間共同的保守域前，突變導致MoC結構域丟失，蛋白質在二級結構上也發生變異。(Buitkamp等，2011；焦士會，2011)

在20世紀80年代，歐洲瑞士褐牛中大量報道了蜘蛛腿綜合征患病個體(等，1987)，2004年，意大利也報道了4頭AS瑞士褐犢牛，并詳細描述了其主要的臨床癥狀和病理特征(Testoni，2004)。科學家對歷經20年時間收集到的15頭患病瑞士褐牛進行系譜分析，所有個體都能追溯到同一個祖先——來自美國Norvic?Larry?牛場的瑞士褐公牛LILASON，并且推斷AS呈現簡單孟德爾隱性遺傳病特征(等，2009)。瑞士褐牛群體有可能是由于大量使用這頭經高度選育的公牛及其后代的凍精，從而引起該病致病基因的廣泛傳播，導致發病。

2009年，等對瑞士褐牛群AS進行了研究，使用了覆蓋牛29對常染色體的240個微衛星標記，對15頭患病個體和36頭已知確認的AS雜合子進行全基因組掃描，將基因定位在BTA5上3個連續標記間。進一步精細定位和單倍型分析的結果揭示導致瑞士褐牛蜘蛛腿綜合征的致病基因可能存在于BTA5上微衛星標記BMS490和DIK5248之間，跨度約8cM，物理距離在7.19Mb范圍內。隨后，等(2010)報道了瑞士褐牛AS是由BTA5定位區間內SUOX基因外顯子4上的一個G的插入c.363-364insG突變所致。經預測，插入突變c.363-364insG會導致SO蛋白的氨基酸序列從124位置發生移碼突變并且會由于移碼提前產生終止密碼子，最終導致發病。

在我國，新疆褐牛(Xinjiang?Brown)是經長期選育培育出來的優秀的乳肉兼用型品種，于1983年通過新疆自治區畜牧廳組織品種審定。新疆褐牛最初是以當地哈薩克牛為母本，引入瑞士褐牛、阿拉托烏牛及少量的科斯特羅姆牛與之雜交改良經長期選育形成。19世紀70年代至今，我國曾大量引入西德、奧地利褐牛和美國瑞士褐牛及其遺傳物質(包括凍精及活體胚胎等)進行新疆褐牛優良遺傳品質及生產性能的鞏固和提高(鄭丕留等，1998)。大量外血的引入對新疆褐牛的生產性能提高發揮了重要作用，然而也可能將一些不利的致病基因引入。據文獻報道，瑞士和奧地利的瑞士褐牛群體中AS致病等位基因估計頻率為0.16(等，2010)，但該致病突變是否已存在于我國新疆褐牛群體中尚處于未知狀態。因此，建立褐牛AS致病位點檢測方法具有重要意義。

PCR產物測序的方法對于尋找DNA序列上的突變是一種準確性最高的檢測方法。使用PCR產物測序的方法，比對測序結果與參考序列能夠快速確定測序個體DNA序列與參考序列的差異。