[發明專利]一種Sublancin抗菌肽的生產方法

無效

• 申請號: 201210076365.3
• 申請日: 2012-03-21
• 公開（公告）號: CN102851339A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 郭文江;祝發明
• 申請（專利權）人: 中農穎泰林州生物科園有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C07K14/32;C12R1/125
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種Sublancin抗菌肽的生產方法。

背景技術

Sublancin抗菌肽是由枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)產生一種具有抗菌活性的內源性多肽。由核糖體合成，通過前導序列進行轉錄后修飾和轉運。其物理性質為無色結晶或白色結晶性粉末，易溶于水。Sublancin含有二硫鍵，因此穩定性好。

Sublancin抗菌肽對革蘭氏陽性菌具有較強抑制和殺滅作用，可應用于食品保鮮、抗感染以及抑制環境消毒。目前，國內外尚未有可實現工業化生產的Sublancin抗菌肽生產方法。關于Sublancin抗菌肽制備方法的報道也比較少。Paik等1998年(Sun?H.Paik，Anu?Chakicherla，and?J.Norman?Hansen.1998.Identification?and?Characterization?of?the?Structural?and?Transporter?Genes?for，and?the?Chemical?and?Biological?Properties?of，Sublancin?168，a?Novel?Lantibiotic?Produced?by?Bacillus?subtilis?168.THE?JOURNAL?OF?BIOLOGICAL?CHEMISTRY.273：23134-23142.)報道了一種在實驗室制備Sublancin抗菌肽的方法。菌株為B.subtilis?168，發酵規模為1L。每1L培養基含蔗糖20g，檸檬酸11.7g，Na₂SO₄?4g，(NH₄)₂HPO₄?4.2g，酵母提取物5g，KCl?0.762g，MgCl₂·6H₂O?0.418g，MnCl₂·4H₂O?0.0543g，FeCl₃·6H₂O?0.049g，ZnCl₂?0.0208g，用NH₄OH調pH?6.8～6.9。發酵條件為37℃通風培養16h后，200rpm搖床37℃培養28h。純化方法為：用磷酸調發酵培養液pH2.5；離心除去細胞；過25ml體積疏水層析柱；凍干；用0.1％的三氟乙酸溶解后離心去掉沉淀；經過2次HPLC反相C-18分析柱的分離純化后，經凍干，于-20℃保存。該方法發酵規模小，產量低而且不穩定。純化過程采用了高精密儀器高效液相色譜(HPLC)，對化學試劑以及操作人員的要求都比較高，這就導致采用此方法精制Sublancin抗菌肽成本高，產量低的特點。因此，上述方法不適用于大規模生產，不能滿足工業化生產的需要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高純度Sublancin抗菌肽的發酵生產和純化的方法，以克服現有技術中沒有工業化生產高純度Sublancin抗菌肽的不足。

本發明通過大量研究，對一系列工藝數據進行探索，通過技術革新，優化了發酵配方和工藝，擴大發酵規模，提高了Sublancin抗菌肽的產量，降低了生產成本，摸索出一套可以大規模生產Sublancin抗菌肽的發酵方法；并進行了純化過程的設計、組合，解決了純化對高精密儀器的依賴和產量低的問題，使Sublancin抗菌肽的純化滿足規模化生產的要求，通過一系列層析技術實現Sublancin抗菌肽的大量純化，最終實現高純度Sublancin抗菌肽的工業化制備。

Sublancin抗菌肽純物質的純化制備流程見圖1。

本發明提供了一種Sublancin抗菌肽的制備方法，所述生產方法包括：

(1)枯草芽孢桿菌接種培養基進行發酵，過濾發酵液；

(2)將步驟(1)得到的發酵液離心，通過陽離子交換層析、疏水層析、尺寸排阻層析、陰離子交換層析，最后超濾濃縮、干燥，即得Ssublancin抗菌肽。

其中，步驟(1)中所使用的菌株為B.subtilis?CVCC20076，發酵液通過陶瓷膜過濾，所述陶瓷膜孔徑為20nm。