[發(fā)明專利]誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的培養(yǎng)液及誘導(dǎo)方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210075531.8
• 申請(qǐng)日: 2012-03-21
• 公開（公告）號(hào): CN102618491A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃家學(xué);楊萍;陳曉波;韓紅起
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 天津才智專利商標(biāo)代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用新型植物誘導(dǎo)劑Conophylline與尼克酰胺聯(lián)合高效誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞分化為功能性胰島樣細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)液及誘導(dǎo)方法和用途。

背景技術(shù)

一型糖尿病又稱為胰島素依賴型糖尿病，是原發(fā)性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病，最終導(dǎo)致β細(xì)胞大量破壞，胰島素分泌不足，血糖濃度調(diào)節(jié)失衡，嚴(yán)重危害人類健康。胰島移植是治療糖尿病的最有效方式，但供體細(xì)胞嚴(yán)重不足，需尋找新的胰島移植替代物。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，它能夠定向誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞。且間充質(zhì)細(xì)胞存在于人體多種組織中，尤其是臍帶、胎盤、脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來(lái)源廣泛、易于采集、無(wú)倫理問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，可規(guī)模化誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，為臨床治療糖尿病提供新的技術(shù)方案。

尼克酰胺是ADP核糖合成酶抑制劑，能促進(jìn)人胎兒胰腺的分化，并在長(zhǎng)期高糖環(huán)境中保持胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖刺激的正常反應(yīng)，因而被廣泛用于胰島素分泌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化環(huán)境構(gòu)成成分。Conophylline具有誘導(dǎo)胰腺前體細(xì)胞模型-AR42J細(xì)胞體外分化為胰島素分泌細(xì)胞的能力，并且和Activin-A相比，Conophylline分子量小，易于滲透，不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，被認(rèn)為是一種神奇的植物誘導(dǎo)劑。已有文獻(xiàn)報(bào)道Conophylline誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞的效率比Activin-A更高。

目前將間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞團(tuán)多采用貼壁誘導(dǎo)的方式。因間充質(zhì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的貼壁性，在誘導(dǎo)過(guò)程中阻礙了細(xì)胞聚集成團(tuán)，因此誘導(dǎo)率普遍較低。二部法或者三步法，誘導(dǎo)因子使用較多，誘導(dǎo)周期一般為14-21天，誘導(dǎo)周期長(zhǎng)、殘留因子種類繁多，增加了臨床應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的培養(yǎng)液及誘導(dǎo)方法和用途。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的培養(yǎng)液，包括尼克酰胺、Conophylline、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞調(diào)節(jié)素和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

每升基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有：

所述細(xì)胞生長(zhǎng)因子為HGF、bFGF或EGF。

所述細(xì)胞調(diào)節(jié)素為Betacellulin。

所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有97％的高糖DMEM、2％的B-27、1％的N-2，所述濃度為體積比濃度。

一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：

(1)配制誘導(dǎo)培養(yǎng)液：以高糖DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加2％的B-27、1％的N-2和誘導(dǎo)劑尼克酰胺、Conophylline、HGF、Betacellulin，混勻，4度保存，所述濃度為體積比濃度；

(2)制備人間充質(zhì)干細(xì)胞；

(3)取人間充質(zhì)干細(xì)胞，以1.5-2×10⁵cells/孔接種于6孔超低吸附培養(yǎng)板中，每孔添加3ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，懸浮誘導(dǎo)；

(4)每3天換液，于9天時(shí)收集細(xì)胞上清液，-20度保存。

含有誘導(dǎo)劑尼克酰胺和Conophylline的培養(yǎng)液在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞分化中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：利用尼克酰胺與Conophylline聯(lián)合誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞團(tuán)分化，縮短誘導(dǎo)周期，使懸浮細(xì)胞利于成團(tuán)，形成類似天然胰島的細(xì)胞團(tuán)，顯著提高誘導(dǎo)分化效率；顯著減少細(xì)胞因子使用種類，降低臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)；顯著提高誘導(dǎo)細(xì)胞胰島素分泌功能。克服了現(xiàn)有誘導(dǎo)劑及誘導(dǎo)方法中細(xì)胞不易聚集成團(tuán)、誘導(dǎo)周期長(zhǎng)、效率低、所得細(xì)胞數(shù)量少、功能差、細(xì)胞易凋亡等缺點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1A是hADSCs原代培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)變化(40×)。

圖1B是hADSCs傳代培養(yǎng)(P6)(4×)。

圖1C是hADSCs生長(zhǎng)曲線。

圖2hADSCs表面特異性蛋白檢測(cè)。

圖3誘導(dǎo)后的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞鑒定(A，B：40×；C：4×；D：10×)。

圖4hADSCs分化與胰島樣細(xì)胞團(tuán)的形成(10×)。

圖5Insulin、c-peptide免疫細(xì)胞化學(xué)分析(40×)。

圖6胰島細(xì)胞分化過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)。

圖7葡萄糖刺激下胰島素的分泌水平(P＜0.001)。

圖8誘導(dǎo)9天后不同誘導(dǎo)組胰島素分泌量(P＜0.05vs(NIC+CNP))。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：