[發明專利]腸桿菌科中沙門氏菌和志賀氏菌的快速篩選方法

有效

• 申請號: 201210074335.9
• 申請日: 2012-03-20
• 公開（公告）號: CN103320491A
• 公開（公告）日: 2013-09-25
• 發明（設計）人: 董根榮
• 申請（專利權）人: 董根榮
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/34;C12Q1/37;C12Q1/44;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 杭州新源專利事務所(普通合伙) 33234
• 代理人: 李大剛

技術領域

本發明涉及一種腸桿菌科中沙門氏菌和志賀氏菌的快速篩選方法。

背景技術

腸桿菌科由一群生物學性狀相似、兼性厭氧、氧化酶陰性的革蘭陰性桿菌組成，其中有一些對人類有較強的致病作用，可引起包括腸道感染、敗血癥和尿路感染在內的許多感染性疾病。沙門氏菌屬和志賀氏菌屬是其中非常重要的致病菌，可引起腹瀉和腸胃炎等。目前篩選沙門氏菌和志賀氏菌的實驗方法較為復雜，并且需要用很多底物，對可疑菌落的篩選也不夠徹底。而臨床實驗室以鑒定為目的的生化試驗通常比較費時、成本也較高，因此急需一種從生長在選擇性腸道培養基上的非致病性細菌中快速篩選出沙門氏菌和志賀氏菌的試驗方法。

發明內容

本發明的目的在于：提供一種腸桿菌科中沙門氏菌和志賀氏菌的快速篩選方法。本發明采用混合底物法對色氨酸脫氨酶、焦谷氨酰氨肽酶和C-8酯酶的活性同時進行檢測，以從培養基上的非致病性細菌中快速篩選出沙門氏菌和志賀氏菌。

本發明的技術方案：腸桿菌科中沙門氏菌和志賀氏菌的快速篩選方法為：將標本劃線于麥康凱瓊脂平板上，于36℃-38℃孵育18-20小時，然后檢查平板上生長的無色菌落；挑出一個無色菌落，將其一部分用于檢測氧化酶活性；另一部分接種于浸有色氨酸、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯的濾紙條上，并用一滴水或緩沖液濕潤；濕潤后的接種條放置于保濕器皿中于36℃-38℃孵育2-3小時，然后將濾紙條置于Wood燈下檢測熒光，熒光陽性表示C-8酯酶活性的存在；在紙條上滴一滴含有重氮染料和氯化鐵的溶液，顏色變紅表示不是沙門氏菌和志賀氏菌；有熒光但不變色表示是沙門氏菌；即無熒光又不變色表示是志賀氏菌。

前述方法中，濾紙的合適浸液量為：在1平方英寸的濾紙上浸有0.2-0.3ml含有色氨酸、焦谷氨酰-4甲氧基萘胺和4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯各40-180微克的20mM?Tris緩沖液，pH為7.5。

前述方法所用的濾紙是Whatman?3號(Whatman?Ltd.Maidstone?England)。

前述方法所用的重氮染料是90-100μg/ml的深紅色GBC鹽，所用的氯化鐵溶液濃度為12-13mg/ml。

本發明實驗檢測結果見下表：

注：*可能為陰性，但一般情況下多為陽性。

本發明采用混合底物法對三種酶(色氨酸脫氨酶、焦谷氨酰氨肽酶和C-8酯酶)的活性同時進行檢測。

苯丙氨酸脫氨酶反應的合適底物是苯丙氨酸；色氨酸脫氨酶反應的合適底物是色氨酸；這兩個反應的顯色劑是氯化鐵。

焦谷氨酰氨肽酶反應的合適底物包括焦谷氨酰-α/β萘胺(pyroglutamyl-alpha/beta?naphthylamide)、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和焦谷氨酰對硝基苯胺(pyroglutamyl?paranitroanalide)。

C-8酯酶反應的合適底物包括熒光素碘苯腈辛酸酯、4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯、鄰/對硝基苯碘苯腈辛酸酯、吲哚氧基碘苯腈辛酸酯、萘碘苯腈辛酸酯和4-甲氧萘碘苯腈辛酸酯。

與現有技術相比：本發明采用混合底物法對三種酶的活性同時進行檢測，實驗方法簡單，所用底物較少，成本較低，能快速從腸桿菌科的非致病性細菌中篩選出沙門氏菌和志賀氏菌。

具體實施方式

本發明的實施例1：將標本劃線于麥康凱瓊脂平板上，于37℃孵育18小時，然后檢查平板上生長的無色菌落；挑出一個無色菌落，將其一部分用于檢測氧化酶活性；另一部分接種于浸有色氨酸、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯的濾紙條上，并用一滴水或緩沖液濕潤。濾紙的合適浸液量為：在1平方英寸的濾紙上浸有0.2ml含有色氨酸、焦谷氨酰-4甲氧基萘胺和4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯各100微克的20mM?Tris緩沖液(pH?7.5)，所用的濾紙是Whatman?3號(Whatman?Ltd.Maidstone?England)。濕潤后的接種條放置于保濕器皿中于37℃孵育2小時，然后將濾紙條置于Wood燈下檢測熒光，熒光陽性表示C-8酯酶活性的存在；在紙條上滴一滴含有重氮染料(90μg/ml的深紅色GBC鹽)和12mg/ml氯化鐵的溶液，顏色變紅→非沙門氏菌和志賀氏菌；有熒光但不變色→沙門氏菌；即無熒光又不變色→志賀氏菌。

本發明的實施例2：將標本劃線于麥康凱瓊脂平板上，于36℃孵育20小時，然后檢查平板上生長的無色菌落；挑出一個無色菌落，將其一部分用于檢測氧化酶活性；另一部分接種于浸有色氨酸、焦谷氨酰-4-甲氧基萘胺和4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯的濾紙條上，并用一滴水或緩沖液濕潤。濾紙的合適浸液量為：在1平方英寸的濾紙上浸有0.3ml含有色氨酸、焦谷氨酰-4甲氧基萘胺和4-甲基傘形酮碘苯腈辛酸酯各160微克的20mM?Tris緩沖液(pH?7.5)，所用的濾紙是Whatman?3號。濕潤后的接種條放置于保濕器皿中于36℃孵育3小時，然后將濾紙條置于Wood燈下檢測熒光，熒光陽性表示C-8酯酶活性的存在；在紙條上滴一滴含有重氮染料(100μg/ml的深紅色GBC鹽)和13mg/ml氯化鐵的溶液，顏色變紅→非沙門氏菌和志賀氏菌；有熒光但不變色→沙門氏菌；即無熒光又不變色→志賀氏菌。