[發明專利]一種利用果蠅細胞生產病毒樣顆粒的方法及應用

無效

• 申請號: 201210073134.7
• 申請日: 2012-03-19
• 公開（公告）號: CN102676461A
• 公開（公告）日: 2012-09-19
• 發明（設計）人: 周保羅;宋宇峰;周梵;楊立飛;蔡車國;丁衡
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N7/04
• 分類號: C12N7/04;C12N5/10;C12N15/63;A61K39/145;A61K39/21;A61K39/165;A61K39/155;A61K39/215;A61K39/12;A61K39/205;A61K48/00;A61P31/14;A61P31/16
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種利用果蠅細胞生產病毒樣顆粒的方法及應用。

背景技術

含有完整且具備生化活性包膜蛋白抗原的病毒樣顆粒(VLP)往往在沒有任何佐劑的情況下，能誘導出很好的免疫反應。此外，因VLP不具有遺傳物質因此不具有復制能力和感染性，與減毒和滅活疫苗相比，VLP的生產和接種更具安全性。事實上，在許多動物模型上的試驗中發現VLP已經是一種極具發展潛力的新型疫苗，目前，已有人類的HPV的及乙肝病毒的VLP疫苗上市。在這里需要指出HPV是非包膜病毒，而HBV的VLP僅含有HBV表面蛋白而不含有病毒的核心，因此，由它們衍生出的VLP與包膜病毒所衍生出的VLP相比更易于大量生產。

目前，包膜病毒如流感和HIV的VLP均是由重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞、編碼病毒包膜蛋白和核心蛋白的DNA質粒共轉染的酵母細胞或哺乳動物細胞(239T細胞、COS細胞和Vero細胞)所產生。釋放在細胞上清液中的VLP在形態上與野生流感和HIV病毒非常相似。然而，目前有關用哺乳或酵母細胞生產VLP的大量研究均依賴于瞬轉系統，所產生的VLP僅能滿足于小動物研究，而不足以用于大動物或者人類研究。為克服這種局限性，用于VLP生產的穩定哺乳動物細胞轉染子隨之產生。盡管此法比瞬轉系統產量高，但仍無法滿足對大動物及人類研究的需求量。

采用重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞可產生出HIV和流感病毒的VLP，所生產出的VLP可誘導體液和細胞免疫反應，并且流感病毒VLP可以保護小鼠免受流感病毒攻毒。同時也嘗試將HA、NA和M1同時構建到單一的重組桿狀病毒載體中，其轉染昆蟲細胞后產生出的VLP同樣可誘導出很好的免疫反應和免疫保護性。然而，用重組桿狀病毒載體轉染昆蟲細胞的方法所生產VLP有三大缺陷。首先，細胞上清液中既含有VLP又存在重組桿狀病毒。盡管蔗糖密度梯度法顯示重組桿狀病毒顆粒密度低于流感VLP，但很難將兩者分離開，所以制備出的VLP中混雜著很多重組桿狀病毒，這會嚴重影響VLP的免疫原性，并干擾了對VLP的質量控制。其次，在哺乳動物細胞中流感HA和HIV包膜蛋白的最初合成是先在內質網上初步形成HA₀和gp160的前體，然后再分別由細胞內源性蛋白酶剪切成HA1和HA2或者gp120和gp41。然而迄今為止，所有相關研究顯示重組桿狀病毒載體轉染的昆蟲細胞所產生的VLP含有HA₀和gp160前體，說明在這種轉染細胞中HA₀和gp160不能得到正常剪切。盡管現在還不是十分清楚未剪切的HA₀前體的存在對VLP的免疫原性和免疫保護性是否有影響，但在HIV研究中已確定gp160前體對HIV的感染性和免疫原性的影響是至關重要的。最后，在細胞被重組桿狀病毒感染后，這些細胞只能在有限的時間(通常5到7天)內存活并表達病毒樣顆粒。因此，每當需要生產表達病毒樣顆粒時，就需要新的重組桿狀病毒去感染細胞，這樣，就會造成每一批表達的病毒樣顆粒在數量和質量上有差異。