[發明專利]一種提高土霉素產量的方法

有效

• 申請號: 201210071770.6
• 申請日: 2012-03-16
• 公開（公告）號: CN103305545A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 郭美錦;張嗣良;于嵐;顏湘云;王龍;儲炬;莊英萍;肖慈英
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N1/21;C12P29/00;C12R1/59
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于鏈霉菌代謝工程技術領域，具體涉及高產土霉素菌株的獲得、穿梭質粒的構建和通過發酵條件優化提高所培育的突變菌株的土霉素產量的方法。

背景技術

早期抗生素高產菌株的方法主要通過傳統菌株的選育獲得，通過比較不同的突變株的芽孢，菌落形態，色素生成及抗生素合成量的比較，來選育高產菌株。在獲得了一些高產或低產突變株后，研究者們開始對抗生素的合成途徑，以及這些突變株與原始菌的區別在DNA水平、表型、生長、代謝途徑的調控等方面進行了深入的研究，利用分子生物學的手段進行基因水平的操作從而獲得高產菌株。但是目前所報道的分子生物學操作獲得的突變株大部分都是利用野生型菌株或標準菌株作為出發菌株，由于這些菌株的遺傳背景較清楚，容易進行基因水平的操作，但是這些菌株本身抗生素的產量低，獲得的突變株與工業生產所用的經過傳統方法誘變獲得的突變株相比產量遠遠不如工業生產菌種。而利用工業生產菌株進行分子生物學改造往往得不到很好的效果，經過多次突變選育得到的工業生產菌株，具有生長周期短、產量高的優點，但是其遺傳背景較為復雜，突變的位點不清楚，在此基礎上進行基因的敲入或敲除往往被染色體上其他的調控基因或回補途徑所干擾，抗生素的產量得不到顯著的提高。這是目前對傳統誘變高產菌株進行基因工程改造的一個重大難點。

目前臨床應用的抗生素大多有鏈霉菌生產，作為抗生素的生產菌株，多種鏈霉菌已經進行全基因組測序，并通過基因序列的同源性比對，對基因的功能進行了預測，大部分抗生素的合成途徑中相關酶的編碼基因是成簇排列的，且大部分代謝途徑專一的調控因子、抗性基因都位于該基因簇的附近，這為基因工程改造提供了便利。

龜裂鏈霉菌(Streptomyces?Rimosus)作為工業用于生產四環素類抗生素的生產菌株，也是土霉素的主要生產菌株。土霉素(Oxytetracycline，OTC)是一種臨床上廣泛應用的廣譜抗生素，由Finlay等人于1950年首次報道在Streptomyces?rimosus中發現。目前報道的OTC生產菌還有：Streptomyces?capuensis，Streptomyces?henetus和Streptomyces?platensis等。OTC對革蘭氏陽性、陰性細菌，螺旋菌，立克次體以及一些病毒具有抗菌性，通過可逆地結合到30S核糖體亞基上，阻止氨酰tRNA核糖體復合體的形成，從而達到抑菌的效果。

然而，為了提高土霉素的產量，本領域還有必要進一步研究提高土霉素產量的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種優化土霉素生產菌使之高產土霉素的方法。

在本發明的第一方面，提供一種增加龜裂鏈霉菌的土霉素產量的方法，所述方法包括：在龜裂鏈霉菌中增加oxyA，oxyB和oxyC基因的表達。

在一個優選例中，在龜裂鏈霉菌中(如基因組中)增加1-8個拷貝的oxyA，oxyB和oxyC基因。

在另一優選例中，所述方法包括：

(1)提供表達載體，所述表達載體中包含oxyA，oxyB和oxyC基因的序列；

(2)將表達載體轉化龜裂鏈霉菌，選擇基因組中整合有(1-8個拷貝；較佳地，1-5拷貝，如3拷貝、2拷貝)外源的oxyA，oxyB和oxyC基因序列的重組龜裂鏈霉菌。

在另一優選例中，oxyA，oxyB，oxyC基因序列分別存在于不同的表達載體中，或存在于同一表達載體中。

在另一優選例中，所述的oxyA，oxyB和oxyC基因序列以串聯的形式存在。

在另一優選例中，所述的oxyA，oxyB或oxyC基因序列之間，存在或不存在連接序列。

在另一優選例中，所述的oxyA，oxyB和oxyC基因序列串聯成SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的表達載體中，oxyA，oxyB和oxyC基因序列的5’端，包括紅霉素抗性基因啟動子(ermE)。

在另一優選例中，所述的表達載體是pSET152載體。

在本發明的另一方面，提供一種重組的龜裂鏈霉菌，其基因組中整合有外源的oxyA，oxyB和oxyC基因。

在一個優選例中，所述的重組的龜裂鏈霉菌中(基因組中)，含有1-8個拷貝的外源的oxyA，oxyB和oxyC基因。

在另一優選例中，所述的重組的龜裂鏈霉菌是通過前面任一所述的方法制備獲得。