[發明專利]彩棉體細胞胚狀體的萌發及成苗方法

無效

• 申請號: 201210071293.3
• 申請日: 2012-03-16
• 公開（公告）號: CN102577980A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 羅俊杰;劉新星;陳玉梁;曲延英;陳子萱;李忠旺;厚毅清
• 申請（專利權）人: 甘肅省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

技術領域

本發明涉及植物組織的萌發及成苗方法，具體涉及彩棉體細胞胚狀體的萌發及成苗方法。

背景技術

隨著基因工程和分子生物學技術的發展，以常規育種方法為基礎，以轉基因技術為核心技術的現代育種技術體系，能夠將外源有益基因導入棉花細胞，并使其定向而穩定的遺傳，結合分子標記輔助選擇技術，可以加快育種進度，提高選擇效率。棉花組織培養理論和技術的發展，對于研究體細胞分化和形態建成的機理、細胞基因的表達和調控及進行遺傳操作具有重要的意義。棉花組織培養具有一定的難度，通過外植體誘導體細胞胚胎萌發存在周期較長、胚發生率低、生根困難、基因型依賴性強等特點。

在棉花體細胞胚胎分化階段主要包括：球形胚，心形胚，魚雷胚和子葉胚等四個階段，其中球形胚、心形胚、魚雷前期胚均不能萌發成苗，只有子葉胚和魚雷后期的胚可以萌發成小植株。因此選擇適宜的培養基和培養條件，獲得更多的子葉胚和魚雷胚是胚性愈傷分化培養的重要目標。研究表明：棉花胚性愈傷組織成熟分化后部分體胚分化成苗，大部分胚性愈傷組織轉化為非胚性愈傷組織，最終喪失體細胞胚胎的發生能力。在胚性愈傷組織發育初期，胚狀體分化主要以球形胚為主，若不加入任何激素，胚性愈傷組織會一直停留在球形胚階段，很難分化成苗，加入細胞分裂素類物質對棉花胚性愈傷組織增殖作用影響不大，但對棉花體細胞胚后期萌發有促進作用，因此棉花體細胞胚的誘導培養基中要添加不同組份的外源激素，促進胚胎萌發和分化。

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，克服了彩棉外植體誘導體細胞胚胎萌發存在周期較長、胚發生率低、生根困難、基因型依賴性強的缺陷，提供了彩棉體細胞胚狀體的萌發方法及成苗方法。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：

彩棉體細胞胚狀體的萌發方法，包括有以下步驟：

1)以彩棉下胚軸培養獲得的胚性愈傷組織，通過增殖培養基繼代培養1-2次；

2)將步驟1)得到的胚性愈傷組織轉接至體胚誘導培養基，繼代培養2-3次后，得到成熟的子葉胚。

上述彩棉體細胞胚狀體的萌發方法，所述步驟2)中，體胚誘導培養基的組成為：去除NH₄NO₃的MSB培養基中加入0.1-0.3mg/L的N6-異戊烯腺嘌呤和0.3-0.5mg/L的吲哚丁酸，并添加1.9-3.8g/L的KNO₃、1.5-2.0g/L的植物凝膠、0.1-0.5g/L的谷氨酰胺和0.1-0.5g/L的天門冬酰胺。

本發明的第二個目的是提供了：彩棉體細胞胚狀體的成苗方法，包括有以下步驟：

1)以彩棉下胚軸培養獲得成熟的子葉胚轉接至分化培養基上，繼代培養2-3次后，分化成苗；

2)將步驟1)得到的再生苗轉接至繼代培養基中，20-25天繼代1次，直至生根；

上述彩棉體細胞胚狀體的成苗方法，所述步驟3)中，成苗培養基的組成為：1/4-1/2的MSB培養基，添加2.0-2.5g/L的植物凝膠、0.1-0.5g/L的天冬酰胺和0.1-0.5g/L的谷氨酰胺。

體細胞胚胎發生是棉花組織培養的關鍵步驟，如果在不加激素的培養基上持續的繼代培養，理論上講是可以實現細胞的胚胎發生，但是體細胞胚的數量很少，而且多數的胚胎會持續停留在球形胚的階段。在成熟的體細胞胚的萌發和生長過程中，培養基中高鹽分是胚狀體成熟、萌發和生根最大的障礙，低鹽分是棉花體細胞胚狀體有效萌發的重要條件。因此，在棉花體細胞培養過程中，按照體胚培養發育階段適當降低培養基中大量元素中鹽的的濃度，才能獲得良好的結果。本方法也證實了這一點，去除NH₄NO₃有利于體細胞胚胎的發生，后期有效胚胎的發生及子葉胚萌發成苗則需要降低MS中的無機鹽成分。同時根據張寶紅等的研究，對棉花體細胞胚胎發生具有促進作用的物質物質有IBA、ABA、IAA、BA、KT、ZT和ZiP，其效果依上述次序遞增。本研究通過對IBA濃度設置梯度，證實了高濃度的IBA，低濃度的KT的組合最有利于胚性愈傷分化。

本發明的有益效果為：