[發明專利]鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201210069525.1
• 申請日: 2012-03-16
• 公開（公告）號: CN102721810A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 丁壯;劉慧;母連志;黃志強;呂字華;宋德武;楊閩楠;賽度
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術領域

本發明涉及一種檢測豬繁殖與呼吸綜合征病的試劑盒，特別是涉及一種能夠鑒別經典豬藍耳病與高致病性豬藍耳病的液相阻斷ELISA制備方法，屬于一種新的動物疫病診斷試劑，主要用于臨床豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱藍耳病、PRRS）與高致病性豬藍耳病（HPRRS）的鑒別診斷及流行病學調查；應用于畜牧獸醫學領域。

背景技術

豬藍耳病即豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV）引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀為特征的一種傳染病。本病于1987年首先爆發于美國，隨后迅速傳到世界各地，現已成為危害規模化養豬生產的重要疫病之一。而2001年至今，我國每年都有部分地區不同程度的受到豬“高熱病”的危害，經一系列的研究表明，引起“高熱病”的最主要病原為變異的高致病性的PRRSV。僅根據臨床癥狀和病變及流行病學特點很難做出診斷，因此PRRS的確診需要借助實驗室診斷技術，特別是新發生本病的地區和豬場。PRRSV屬套式病毒目，動脈炎病毒科，動脈炎病毒屬，單股正鏈有囊膜的RNA病毒，病毒粒子呈球形或卵圓形，直徑為45~65nm，含有20~35nm的核衣殼，呈二十面體對稱，外繞一脂質雙層膜，表面有纖突，較小且不清楚。在我國分離的毒株屬于美洲型，如VR2332株。經測序表明，與經典毒株相比，HPRRS病原的序列變化主要是在Nsp2區缺失了30個氨基酸，并且致死率明顯高于經典毒株。可見，Nsp2中30個氨基酸的缺失與否，成為鑒別高致病性豬藍耳病與經典豬藍耳病的重要指標。

目前針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測主要采用的技術方法有：病毒分離、免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA）、血清中和試驗（SVN）、間接熒光抗體試驗（IFA）、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金技術、反轉錄、聚合酶鏈式反應（RT—PCR）、等。上述檢測PRRSV抗體的技術多針對結構蛋白，而有關PRRSV非結構蛋白抗體的檢測方法還未見報道，且不便于經典豬藍耳病及高致病性豬藍耳病的鑒別檢測。這些限制了對豬藍耳病的預防控制，因此研制出一種特異性強、靈敏度高、簡單易行的診斷方法迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，基于二者差異，利用固相酶聯免疫吸附試驗（ELISA）原理，以經典PRRSV特有抗原為包被抗原，結合單抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG及其他配套試劑組成。其反應機理為包被抗原和樣品中抗經典PRRSV特有抗原的抗體結合導致單抗和抗原的結合量減少，通過酶標抗體形成“包被抗原+結合單抗+酶標抗體”復合物，加入顯色劑，通過酶催化反應顯色，顯色深淺與樣品中的檢測抗體含量成反比。當抑制率高于設定的臨界值時結果判為陽性，表明有抗經典PRRSV抗體存在。判定結果是這樣設定的：抑制率PI=(OD_未抑制-OD_樣品)?/OD_未抑制*100%，PI>20%對應的樣品為陽性，小于則為陰性。具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點；適用于臨床鑒別經典豬藍耳病與高致病性豬藍耳病。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種能夠鑒別經典PRRS與HPRRS的液相阻斷ELISA試劑盒，由96孔ELISA板、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、羊抗小鼠IgG-HRP結合物、結合單抗、終止液、底物A??、底物B??、陽性樣品、陰性樣品、蓋板膜組成，其特征在于：其中結合單抗為抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸單克隆抗體2B9，其制備方法如下：首先制備抗經典豬藍耳病Nsp2蛋白特有30個氨基酸單克隆抗體，利用雜交瘤技術通過細胞融合、細胞克隆篩選建立的抗經典PRRSV單克隆抗體2B9，所制備單抗只針對經典豬藍耳病Nsp2蛋白中30個氨基酸，而對高致病性PRRSV抗原無特異性反應，這就決定了試劑盒的特異性；

所述的96孔ELISA板上包被的抗原為由公司合成的經典藍耳病Nsp2蛋白區特有的30個氨基酸，用包被緩沖液將抗原稀釋到0.7ug/mL，37℃包被1h后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉1h，PBS洗滌5次干燥后用鋁箔真空密封。

本發明的積極效果是