[發(fā)明專利]一種用于檢測豬流感病毒的NASBA方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210069267.7
• 申請日: 2012-03-16
• 公開（公告）號: CN102534052A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄢明華;張莉;張榮升;崔尚金;李秀麗;吳瑩;高榮玲;張國偉;任衛(wèi)科;王志軍
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.一對針對A型豬流感病毒NP基因的特異性擴增引物，其特征在于所述的擴增引物如SEQ?NO：1，SEQ?NO：2所示。

2.一種采用權(quán)利要求1所述的特異性擴增引物檢測豬流感病毒NASBA的方法，其特征在于按如下的步驟進行：

（1）提取病毒RNA：使用TRIZOL?試劑提取RNA；

（2）NASBA擴增體系：

將待檢樣品RNA??3μl；

緩沖液??????????4μl

10mM/L?dNTP????2μl

20mM/L?NTP?????2μl?

DMSO???????????1μl

引物NP-T7???????2μl

引物NP-DET?????2μl

（3）NASBA擴增程序：

在DNA擴增儀上65℃加熱5min，41℃冷卻5min，迅速加入4μl酶混合液，41℃反應(yīng)90min；4℃終止反應(yīng)；

（4）NASBA?擴增產(chǎn)物鑒定

1）將部分豬流感分離株的NASBA擴增產(chǎn)物稀釋10倍，作為模板進行反轉(zhuǎn)錄后；

2）反轉(zhuǎn)錄體系：5X?RT?buffer??4μL、2.5mmol??dNTP4μL、Random?Primer?1μL、RNase?inhibitor?0.5μL、AMV?1μL、10倍稀釋的NASBA擴增產(chǎn)物?9.5μL；

3）反轉(zhuǎn)錄程序：?將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)管在PCR儀上按以下程序反應(yīng)：?

30℃，10min，42℃，1h，99℃，5min，迅速降溫到4℃；

（5）PCR擴增???

1）引物：

NP-DET：5′-GATGCTAGGTCGCATATGAGTC-3′

NP-T7：5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGCGGATGCCTTCTGTT?-3′

2）PCR反應(yīng)體系：10XRT-PCR?buffer?2μL、Mgcl₂?1μL、dNTP??2μL、NP-DET?1μL、NP-T7??1μL、taq?0.5μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物9.5μL、水?3μL；

3）PCR擴增程序：將PCR反應(yīng)管放入在PCR儀上按以下程序反應(yīng)：95℃反應(yīng)5min后；94℃?30s，56℃?30s，72℃?30s，三個溫度循環(huán)反應(yīng)35個循環(huán)；72℃?10min，4℃?終止反應(yīng)；

4）PCR結(jié)果觀察：用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

3.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（2）中所指的緩沖液為含40mM/L??PH8.5?Tris-HCL，70mM?/L?KCl，12mM/L?MgCl₂，5mM/L?DTT緩沖液。

4.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟（3）中所指的酶混合液包含1～2U?AMV，0.2～0.5U?RNaseH，30～50U?T7?RNA?聚合酶，2~6μl?1mg/mlBSA。