[發明專利]腸出血性大腸桿菌O104︰H4檢測試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201210068180.8
• 申請日: 2012-03-15
• 公開（公告）號: CN102605069A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 盧柳燕;吳成貢;龔劍;董紹旺;田仁鵬;汪再興;黃娟
• 申請（專利權）人: 深圳市生科源技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

1.一種腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，包含PCR反應液，所述PCR反應液包含第一反應液、第二反應液及穩定劑，其特征在于，所述第一反應液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因為靶基因，并用于熒光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探針、fliC(H4)基因的引物探針和aggR基因的引物探針。

2.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，

所述wzy(O104)基因的引物探針為：

wzy(O104)基因的引物：

49F：5’-TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’(SEQ?ID?NO：1)，

49R：5’-TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’(SEQ?ID?NO：2)，

wzy(O104)基因的探針：

49A：5’-(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’(SEQ?ID?NO：3)；

所述fliC(H4)基因的引物探針為：

fliC(H4)基因的引物：

50F：5’-GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’(SEQ?ID?NO：4)，

50R：5’-GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’(SEQ?ID?NO：5)，

fliC(H4)基因的探針：

50H：5’-(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’(SEQ?ID?NO：6)；

所述aggR基因的引物探針為：

aggR基因的引物：

51F：5’-GCAATACATATCTTAGAAATG-3’(SEQ?ID?NO：7)，

51R：5’-CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’(SEQ?ID?NO：8)，

aggR基因的探針：

51X：5’-(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’(SEQ?ID?NO：9)。

3.根據權利要求2所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述第一反應液還包括不含鎂離子的10×buffer、MgCl₂、dNTPs、滅菌超純水，所述第一反應液各組分體積份數為：

4.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述第二反應液由DNA聚合酶、顯色液和滅菌超純水組成。

5.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為Taq酶，其濃度為5-10U/μl，所述顯色液為溴酚藍，且所述第二反應液各組分體積份數為：

所述Taq酶????????????0.15-0.3體積份數

溴酚藍???????????????0.01-0.02體積份數，

滅菌超純水???????????1.68-1.84體積份數。

6.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述穩定劑為石蠟，且所述第一反應液與所述第二反應液被所述石蠟分隔開，所述第一反應液位于所述石蠟下方，所述第二反應液在所述石蠟上方。

7.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒還包含DNA提取液、陰性對照液和陽性對照液。

8.根據權利要求7所述的腸出血性大腸桿菌O104:H4檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液為0.01M-0.02M的pH7.98-8.02的Tris-EDTA緩沖液，所述Tris-EDTA緩沖液含體積百分比為0.01％-0.02％的NP-40；所述陰性對照液為不含腸出血性大腸桿菌O104:H4的基因組DNA的0.01-0.02M?pH7.98-8.02的Tris-EDTA緩沖液；所述陽性對照液為含有腸出血性大腸桿菌O104:H4的基因組DNA的0.01-0.02M?pH7.98-8.02的Tris-EDTA緩沖液。