[發明專利]天山雪蓮細胞培養生產紫丁香苷、綠原酸和1,5-二咖啡酰奎尼酸的方法

在審

• 申請號: 201210067580.7
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN103305454A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 戴均貴;陳日道;楊林
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥物研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N5/02;C07H15/203;C07H1/08;C07C69/732;C07C67/48
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 何文彬

1.一種制備紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采用來自天山雪蓮的外植體誘導產生離體組織細胞，所用培養基為MS培養基；

(2)離體組織細胞在同樣組成的培養基中繼代培養，經篩選得到高產紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三種目標成分的天山雪蓮組織細胞系；

(3)將步驟2篩選得到的天山雪蓮組織細胞系轉入液體培養基中進行搖瓶懸浮培養，建立懸浮培養細胞系；

(4)采用次生代謝調控的技術策略提高天山雪蓮細胞懸浮培養體系生產三種目標成分的能力；

(5)搖瓶培養或生物反應器培養方式用于天山雪蓮細胞培養及三種目標成分的生產；

(6)培養細胞經溶劑提取，結合多種色譜分離技術簡便高效地制備紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸三種物質。

2.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的天山雪蓮的外植體選自野生天山雪蓮植株、再生苗或種子萌發后的無菌苗的外植體；所述的MS培養基中附加植物激素α-萘乙酸、6-芐基嘌呤和2，4-二氯苯氧乙酸的。

3.權利要求2的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的外植體所述的選自葉片、子葉、根、莖、胚軸、胚芽；所述的α-萘乙酸的濃度范圍是0.1～10.0mg·L^-1、6-芐基嘌呤的濃度范圍是0.1～10.0mg·L^-1、2，4-二氯苯氧乙酸的濃度范圍是0.1～10.0mg·L^-1。

4.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的繼代培養選用生長狀態較好的疏松、淺黃色組織細胞為種子，黑暗條件下繼代培養；所述的篩選方式為結合紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸含量分析，篩選穩定、高產的天山雪蓮細胞系。

5.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(3)以高產紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的天山雪蓮細胞系為種子，以細胞呈顆粒性、分散性好、生長迅速、生物量高和/或目標成分產量高為標準，篩選并建立穩定高產的細胞懸浮培養體系。

6.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(3)采用搖床旋轉振蕩培養，接種量為1～20g細胞干重每升培養基，黑暗條件下進行懸浮培養，每7d～15d繼代1次。

7.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(4)采用環境控制、優化碳源、添加前體物質和添加誘導子的技術策略提高天山雪蓮細胞生產三種目標成分的能力。

8.權利要求7的方法，其特征在于，所述的碳源是蔗糖、所述的前體物質選自L-苯丙氨酸、所述的誘導子選自茉莉酸甲酯。

所述的蔗糖的濃度是1％～20％，所述的L-苯丙氨酸的濃度是20～2000mg·L^-1；所述茉莉酸甲酯的濃度是10～500mg·L^-1。

9.權利要求1的方法，其特征在于，

步驟(5)應用搖瓶培養時培養基為附加0.1～10.0mg·L^-1α-萘乙酸、0.1～10.0mg·L^-16-芐基嘌呤、0.1～10.0mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸；

步驟(5)應用的生物反應器為氣升或攪拌動力的反應器，反應器的工作參數為：用附加0.1～10.0mg·L^-1α-萘乙酸、0.1～10.0mg·L^-16-芐基嘌呤、0.1～10.0mg·L^-12，4-二氯苯氧乙酸、20～2000mg·L^-1L-苯丙氨酸和1％～20％蔗糖的MS液體培養基，在培養過程中添加10mg·L^-1～500mg·L^-1茉莉酸甲酯，反應器工作體積40％～80％，接種量1～20g·L^-1，通氣量50～1000mL·min^-1、轉速0～200rpm，并添加二甲基硅類消泡劑0～10mL·L^-1，培養在黑暗下進行。

10.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(6)采用20～80％的醇溶液為提取溶劑，浸膏加適量水分散，采用大孔樹脂吸附、硅膠柱色譜分離，高效率地分別得到較高純度的紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸組份。

11.權利要求1的方法，其特征在于，步驟(6)培養細胞成分經大孔樹脂吸附富集后，根據3種目標成分的理化性質差異，運用硅膠柱色譜、Sephadex?LH-20凝膠柱色譜、制備型高效液相色譜多種色譜手段，制備高純度紫丁香苷、綠原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸。