[發(fā)明專利]青霉菌細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)組的提取

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210066837.7
• 申請(qǐng)日: 2012-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN103304625A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 元英進(jìn);程景勝;喬斌;丁明珠;盧華;陳堯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K1/14
• 分類號(hào): C07K1/14
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種青霉菌細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)和發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)的提取。

背景技術(shù)

作為一個(gè)最大的全球銷售類抗生素藥物，用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的青霉菌經(jīng)過(guò)多次菌種改良，并且人們已經(jīng)清楚描述了關(guān)于青霉素的生物合成途徑。由于可以獲得青霉菌的基因序列，使得現(xiàn)在在蛋白組學(xué)水平上研究青霉素G的生產(chǎn)成為可能。然而，除青霉素合成基因、代謝工程和微體蛋白組學(xué)分析外，很少有人研究該真菌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的蛋白組，尤其是在可能直接或間接參與青霉素生物合成的工業(yè)發(fā)酵條件下的情況。據(jù)報(bào)道自溶導(dǎo)致青霉素V的降解、培養(yǎng)基濾過(guò)性等問(wèn)題，這些與在產(chǎn)黃青霉的工業(yè)菌株批量培養(yǎng)中細(xì)胞內(nèi)解朊作用和β-1-3-glucanolytic酶活性的增加密切相關(guān)。產(chǎn)黃青霉工業(yè)菌株在碳源和氮源受限時(shí)，絲氨酸和天門冬氨酰蛋白酶、金屬蛋白酶都與自溶密切相關(guān)。可見探究工業(yè)發(fā)酵條件下產(chǎn)黃青霉菌的胞內(nèi)外蛋白是非常有必要的，能夠幫助我們理解其自溶和青霉素的降解機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種方便有效的青霉菌細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)組的提取。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

青霉菌細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)組的提取，包括如下步驟：

(1)細(xì)胞內(nèi)蛋白的提取：

在LB培養(yǎng)基中接種青霉菌，培養(yǎng)，從接種1～2h起至170～180h，選8～12個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集1～3份細(xì)胞，每份細(xì)胞分別用冰浴的0.5～5mM苯甲基磺酰化氟-超純水溶液洗滌3～5次；-10～4℃收集洗滌后的細(xì)胞，在液氮中研磨成細(xì)胞粉末；取0.1～1g所述細(xì)胞粉末懸浮于裂解緩沖液中，再加入10～15μl?DNase?I和RNaseA的水溶液，冰浴放置15～30min，加入10～15μl濃度為0.8～1.2mM苯甲基磺酰化氟-異丙醇溶液，超聲10～15秒/次，共3～5次，在10,000～100,000xg的轉(zhuǎn)速下離心10～60min后，收集上清液，在-15～-30℃的條件下與1～10倍于上清液體積的冰浴的丙酮混合，放置2～10h；在10,000～100,000xg的轉(zhuǎn)速下離心10～60min，將沉淀物凍干，得到細(xì)胞內(nèi)蛋白組，用Bradford方法測(cè)定蛋白含量；

所述裂解緩沖液的配制為：5～8mol尿素、1～3mol硫脲、10～50mg?3-((3-膽汁氨丙基)二甲基胺)-1-丙磺酸、20～50mmol?Tris堿，加水定容至1L；

所述DNase?I和RNaseA的水溶液的配制為：8～15mg?DNaseI，2～4mg?RNaseA、30～60mmol?MgCl₂、0.1～1mol?Tris-HCl，調(diào)pH為7.0，加水定容至1L；

(2)細(xì)胞外蛋白的提取：

在LB培養(yǎng)基中接種青霉菌，培養(yǎng)，在生長(zhǎng)周期的OD₅₄₀值分別在1～10之間取3-5份1L的發(fā)酵液，在1～10℃，10,000～100,000xg的轉(zhuǎn)速下離心10～60min，上清液通過(guò)0.1～1μm孔徑過(guò)濾，濾液加入冰浴三氯乙酸至三氯乙酸終濃度為10～20mg/100ml進(jìn)行沉淀，用體積濃度為80％-90％的丙酮水溶液洗滌沉淀4-5次，得到細(xì)胞外蛋白組，用Bradford方法測(cè)定蛋白含量。

所述時(shí)間點(diǎn)為10個(gè)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集2～3份細(xì)胞。

所述苯甲基磺酰化氟-超純水溶液的濃度為1～2mM。

所述步驟(1)或步驟(2)中轉(zhuǎn)速為20,000xg，離心時(shí)間為40min。

所述DNase?I和RNaseA的水溶液的配制中所述DNase?I為10～12mg。

所述DNase?I和RNaseA的水溶液的配制中所述RNaseA為2.5～3mg。

所述苯甲基磺酰化氟-異丙醇溶液的濃度為1mM。

所述步驟(1)中上清液與冰浴的丙酮混合時(shí)的溫度條件為-20℃。

所述步驟(2)中發(fā)酵液的份數(shù)為4份。

所述步驟(2)中所述孔徑為0.45μm。

本發(fā)明提供了一種有效的青霉菌細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)組的提取，利用本發(fā)明的方法可以方便有效的提取蛋白，為鑒定不同工業(yè)發(fā)酵條件下蛋白變化奠定了基礎(chǔ)。