[發明專利]一種多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法

有效

• 申請號: 201210066536.4
• 申請日: 2012-03-14
• 公開（公告）號: CN102586456A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 李鵬翔;陳燁;肖君華;陸炯;陳軼群
• 申請（專利權）人: 上海翼和應用生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種基于熒光通用引物的多重競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法，包括以下步驟：

(1)提供多重競爭性PCR引物，由至少一對通用熒光引物、至少一對位于待測基因上下游的嵌合特異引物和至少三對參照引物組成：

所述通用熒光引物長度范圍為10～25bp，5’端用熒光標記，TM值≤57℃值，且通用引物對待測基因組具有特異性；

所述嵌合特異引物和所述參照引物針對檢測區段和參照區段設計，TM值≥62℃，長度范圍為28～50bp，3’端為18～25bp的特異引物序列，5’端為所述通用引物序列，所述3’端和5’端的序列之間插入兩個堿基的固定組合；所有嵌合引物之間的TM值的差異不超過3℃；所述三對參照引物設計在相同或不同的參照區段上，且與待測基因無特異性匹配；

所述多重競爭性PCR引物所產生的不同擴增產物片段之間有可檢出的長度差異；

(2)定量合成內對照DNA片段：針對每一個待測區段和每一個參照區段的擴增產物片段，合成相對應的內對照序列，并進行精確定量；所述內對照序列與所述待測區段和參照區段的擴增產物片段相比插入或缺失2～3bp的DNA片段；

(3)多重競爭性PCR的反應過程：

(a)將含待測區段和參照區段的待測樣本和對照樣本分別與相等或整數倍mol數的內對照DNA片段混合在一起，然后進行PCR，前3～16個循環，退火溫度高于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述嵌合特異引物引導的擴增，后17～20個循環，退火溫度低于所述通用熒光引物的退火溫度，用于所述通用引物引導的擴增，兩組退火溫度的差距≥5℃；

(b)根據熒光標記PCR擴增產物長度不同，對擴增產物片段進行檢測，獲得待測樣本中待測區段和參照區段以及內對照擴增產物片段的長度信息與相應的熒光強度信息；

(4)數據分析

i.計算每個待測區段和參照區段的樣本峰高和/或峰面積(S)和內對照的峰高和或峰面積(I)，得到每個待測區段和參照區段的比值(S/I)；

ii.以一個參照區段的比值為標準，將所有待測區段和參照區段的比值同其作比，進行數據內部標化；

iii.按照i和ii的步驟將對照樣本進行數據內部標化；

iv.將待測樣本和對照樣本的內部標化值作比，獲得待測樣本與對照樣本的比值，該比值乘以對照樣本的拷貝數，得到待測樣本的拷貝數。

2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述通用熒光引物長度范圍為18～20bp。

3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物的長度范圍為38～45bp。

4.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述多重PCR引物對應的擴增產物的長度范圍為120～350bp，不同擴增產物片段的長度差異為8～50bp。

5.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述嵌合特異引物和所述參照引物的3’端的特異引物序列段長度為18～20bp。

6.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一到四對不同熒光標記的通用熒光引物、一到二十五對針對相同或不同待測基因的嵌合特異引物和三到六對針對相同或不同基因的參照引物組成。

7.根據權利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的多重競爭性PCR引物由一對通用熒光引物、一到五對針對不同待測基因的嵌合特異引物和三到五對參照引物組成。

8.根據權利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述的三到六對參照引物中至少兩對設計在常染色體上，至少一對設計在X染色體上。

9.權利要求1所述的分析方法在檢測基因拷貝數變異中的應用。

10.一種基于權利要求1所述的分析方法的試劑盒，提供通用熒光引物、嵌合特異引物、參照引物和定量的內對照DNA、和/或多重競爭性PCR的反應的試劑。