[發明專利]一種快速構建復層細胞的方法

有效

• 申請號: 201210066512.9
• 申請日: 2012-03-13
• 公開（公告）號: CN102614547A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 王智崇;武征;周強
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;莫瑤江

技術領域：

本發明屬于組織工程領域，具體的說是涉及一種快速構建復層細胞的方法。

背景技術：

組織工程的核心就是建立細胞與生物材料的三維空間復合體，用以對病變或受損組織進行形態、結構和功能的重建并達到永久性替代。對于多細胞結構的復雜組織器官來說，細胞結構基礎決定著組織器官的功能，如何制備具有生命力的復層細胞結構，對于本領域的發展和臨床的實際應用具有重要的作用。

常規的復層細胞構建方法為：種植細胞逐層生長法，首先種植單層細胞，底層細胞可借助靜電吸附或與細胞外基質的配體結合來粘附，經歷足夠時間后，單層細胞間可實現細胞融合，并進一步形成一定強度的細胞連接，繼續給以一定的促生長或促分化培養條件，使其再逐層增殖或分化為復層細胞。其基本特點可概括為：形成單層細胞→單層細胞間連接形成→形成復層細胞。這種最為常規的培養細胞復層的方法被廣泛應用于心肌、氣管、皮膚和角膜組織的復層細胞構建研究中，雖然可最終形成與天然類似的大體組織學結構，但卻存在如下明顯的限制性因素：①構建復層細胞組織所需時間不具備臨床應用的可行性：單層細胞增殖到融合，細胞與細胞之間受體特性體連接的形成，單層細胞的2維生長向復層細胞3維生長的轉變，均需較多的構建時間(數周)。對于需要組織工程產品替代的急性組織缺損來說，數周的體外構建時間，已經遠遠超出了臨床診治時所能提供的治療時限。②生物學和物理學功能不完善：目前的體外生物反應器還無法完全模擬體內條件下細胞生長所面對的真正微環境，其提供的營養和氧氣供應方式以及代謝廢物的去除方式，與體內條件差異仍然很大。因此，較長的構建時間通常會導致構建的細胞復層出現細胞過度分化和老化，各種細胞的黏附和增殖功能也會不斷下降，同時細胞復層的各種物理學功能(細胞層的生物力學強度、電生理功能、組織極性等)也會相應下降。這些構建組織的各種功能學不足也嚴重制約了最終的臨床應用。

發明內容：

本發明的目的是提供一種構建時間短，構建的復層細胞具備更好的生物力學強度和更好的細胞生物學功能的快速構建復層細胞的方法。

本發明的快速構建復層細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a)將種子細胞和液態的細胞外基質凝膠混懸得到液體混懸液；

b)將液態混懸液置于構建載體上，使載體上的液態混懸液凝固成固態凝膠，直接形成復層細胞結構，然后加入培養液培養復層細胞至足夠強度。

所述的種子細胞指的是所需構建復層細胞組織的細胞，這些細胞可以經過體外培養擴增或是從組織塊中新鮮分離，如角膜上皮細胞、表皮上皮細胞、成纖維上皮細胞或心肌細胞。

所述的細胞外基質凝膠是指所需構建組織的細胞(種子細胞)相對應的細胞外基質成分的混合物或者單一成分所形成的凝膠，如角膜上皮細胞(種子細胞)對應角膜基質凝膠，人表皮上皮細胞和成纖維細胞(種子細胞)對應人皮膚基質凝膠，心肌細胞(種子細胞)對應心臟基質凝膠。可以為所需構建組織的細胞外基質蛋白質、多糖和糖蛋白的混合物或單一成份所形成的凝膠。本領域技術人員可以根據所需構建組織的細胞，按照本領域的常規知識獲取其該細胞外基質凝膠。如利用各種變性蛋白質提取方法或非變性蛋白質提取方法，從天然動物組織中提取并純化出各種細胞外基質蛋白的單一成分或者混合成分制備凝膠溶液。優選利用非變性蛋白質提取方法，提取所構建組織的細胞外基質蛋白質、多糖和糖蛋白的混合物或單一成分來制備基質凝膠。這種凝膠的突出優點在于提供了種子細胞本身的基質微環境，可有效的結合種子細胞表面的各種整合素受體，避免種子細胞凋亡。同時這種基質凝膠可以吸附各種生長因子，達到生理狀態的緩釋效果。一般可通過控制細胞外基質凝膠的溫度和濃度使其呈液態，優選溫度為20～37℃。

所述的構建載體指的是利用天然組織脫細胞基質形成天然支架材料，或是利用合成材料構建的高分子支架材料，其主要起載體作用。利用合成材料構建的高分子支架材料可以從現有技術中購買，而利用天然組織脫細胞基質形成天然支架材料屬于常規技術。所述的構建載體優選為利用脫細胞角膜基質、脫細胞皮膚基質或脫細胞心臟基質形成的天然支架材料。

所述的將載體上的液態混懸液凝固成固態凝膠，其方法包括降低溫度或使液態混懸液脫水以提高凝膠濃度或兩者的結合來使液態混懸液凝固成固態凝膠。所述的降低溫度是指降低液態混懸液的濃度從而使液態混懸液形成固態凝膠的溫度，優選溫度為4～20℃。所述的使液態混懸液脫水以提高凝膠濃度優選利用載體的吸水性實現液態混懸液的脫水從而提高凝膠濃度使液態混懸液形成固態凝膠或利用負壓蒸發的方式脫水濃縮液態混懸液形成固態凝膠。