[發(fā)明專利]一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物脂質(zhì)體

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210064390.X
• 申請(qǐng)日: 2012-03-12
• 公開（公告）號(hào): CN102716498A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝小明;李來勝;謝新華;郭姣麗;伍民慶;孔亞楠;韋尉東;肖祥勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)腫瘤防治中心
• 主分類號(hào): A61K48/00
• 分類號(hào): A61K48/00;A61K9/127;A61P35/00;A61K31/513
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體涉及一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞T-VISA-miR34a治療載體及其藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體。?

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害了人類的身體健康。乳腺癌療效較好，但是仍有一部分患者綜合治療后會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對(duì)現(xiàn)有藥物療效很差。microRNAs(miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度為18-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA。它主要通過與靶標(biāo)基因3’UTR的完全或不完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)。miRNA在人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色，發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，有望成為癌癥治療的作用靶點(diǎn)。因此，迫切需要探索高效靶向殺滅乳腺癌的新藥物。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高效靶向乳腺癌BCL-2，CD44靶點(diǎn)，可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的T-VISA-miR34a治療載體。?

本發(fā)明的可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的T-VISA-miR34a治療載體，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

本發(fā)明克隆端粒酶啟動(dòng)子hTERT，長(zhǎng)度為418bp，具有腫瘤細(xì)胞特異性，但其活性在腫瘤細(xì)胞中不到CMV啟動(dòng)子活性的1％，因此無法廣泛應(yīng)用，本發(fā)明首先將hTERT啟動(dòng)子控制Gal4-VP2(兩個(gè)拷貝的VP16，具有強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄激活特性)融合蛋白基因；再將Gal4-VP2?融合蛋白與Gal4效應(yīng)元件G5E4T結(jié)合，啟動(dòng)靶基因或目的基因的大量轉(zhuǎn)錄；然后將WPRE位于目的基因的3-UTR，增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的作用，由此構(gòu)建得到hTERT-VP16-GAL4-WPRE(VP16-GAL4-WPRE?Integrated?Systemic?Amplifier，VISA，整合性系統(tǒng)放大器)調(diào)控系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱為T-VISA(整合性系統(tǒng)放大器)系統(tǒng)，最后，結(jié)合miR34a作為治療基因，建立T-VISA-miR34a治療載體，該T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體，其特征在于，包括脂質(zhì)體和被脂質(zhì)體包被的T-VISA-miR34a治療載體，所述的T-VISA-miR34a治療載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

所述的脂質(zhì)體可以使用按照常規(guī)方法制備的脂質(zhì)體，優(yōu)選是通過以下方法制備的脂質(zhì)體：按照1摩爾膽固醇對(duì)應(yīng)1.7摩爾磷脂酰膽堿的比例，秤取磷脂酰膽堿與膽固醇，用磷脂酰膽堿質(zhì)量1/4的氯仿作為溶劑溶解磷脂酰膽堿與膽固醇，將上述溶液置于旋轉(zhuǎn)燒瓶中，旋轉(zhuǎn)燒瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶劑，得到一層附著在燒瓶壁上的脂膜；然后再用按8.9/100ml/g磷脂酰膽堿的量加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋轉(zhuǎn)真空干燥，然后再加入雙蒸水至上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的葡萄糖溶液的體積，在50℃的超聲水浴箱中進(jìn)行超聲處理1min，再在50℃下收集通過0.1μm的聚碳酸酯膜濾膜的脂質(zhì)體。通過該方法制備的脂質(zhì)體粒徑為180nm左右，容許其穿透腫瘤細(xì)胞中極細(xì)的毛細(xì)血管并被細(xì)胞攝取。?

所述的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體優(yōu)選通過以下方法制備的，將上述脂質(zhì)體加入到5％的葡萄糖溶液中使脂質(zhì)體的濃度為8mM，將T-VISA-miR34a治療載體加入到5％的葡萄糖溶液中使T-VISA-miR34a治療載體的濃度為1μg/ml，然后將脂質(zhì)體溶液和T-VISA-miR34a治療載體溶液混合靜置20min，由此得到藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體。利用該方法制備得到的藥?物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體的粒徑200～300nm，穩(wěn)定性好，在4～8℃，1-2年無降解。?

本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體與5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體存在協(xié)同作用，因此本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種可高效高特異滅殺P53基因突變型乳腺癌細(xì)胞的藥物，其特征在于，由藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體和5-氟尿嘧啶脂質(zhì)體組成。?

本發(fā)明的藥物T-VISA-miR34a脂質(zhì)體在體外能高效殺滅P53基因突變的乳腺癌細(xì)胞系，而對(duì)正常細(xì)胞無殺滅作用。?