[發明專利]一株調節人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌及檢測方法

無效

• 申請號: 201210062159.7
• 申請日: 2012-03-09
• 公開（公告）號: CN102618460A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 張佳超
• 申請（專利權）人: 北京和美科盛生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;G01N30/88;G01N33/543;C12R1/25
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 李正清

1.一株調節人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus?plantarum?P8)分離自內蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號：CGMCC?No.5468，保藏日期為：2011年11月18日。

2.調節人腸道中短鏈脂肪酸和總膽汁酸代謝的益生菌的檢測方法，其特征是包括下列步驟：

(I)、高效液相色譜用于短鏈脂肪酸的測定

(1)儀器和材料

Agilent1100液相色譜系統、Agilent色譜工作站、5μm，4.6mm×150mm的Zorbax?SB-Aq色譜柱、水的電阻大于17MΩ的水凈化系統、乙腈、甲醇、乙酸、丙酸、丁酸、濃度為0.015mol/L磷酸-磷酸鹽緩沖液(pH＝2.5)；標樣：濃度為0.1mol/L乙酸、丙酸、丁酸和濃度為0.01mol/L的混合樣；

(2)糞便樣品預處理

把糞便樣品解凍后稱取1g置于15mL?PBS中充分懸浮，離心(350g)5min，吸取1mL濁液加4mL濃度為1mol/L的鹽酸溶液振蕩30s，離心(4500g)10min，取清液經0.45μm膜過濾待進樣分析；

(3)色譜條件

流動相：甲醇和緩沖溶液的體積比為3∶97，所述緩沖溶液為濃度為0.015mol/L、pH＝2.5的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min，紫外檢測波長為210nm，柱溫為35℃，進樣量為5μL。

(II)ELISA用于總膽汁酸的測定

(1)糞便樣品預處理

把糞便樣品解凍后稱取1g置于15mL?PBS中充分懸浮，離心(350g)5min，吸取5mL濁液，離心(8000g)10min，取1mL清液，離心20分鐘(2000-3000轉/分)，仔細收集上清，分裝后一份待檢測，其余冷凍備用；

(2)標準品的稀釋與加樣

在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉；稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為9μmol/L、6μmol/L、3μmol/L、1.5μmol/L和0.75μmol/L；

(3)加樣

分別設空白孔，空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同，待測樣品孔；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl，樣品最終稀釋度為5倍；加樣將樣品加于酶標板孔底部，晃動混勻；

(4)溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；

(5)配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；

(6)洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復多次并拍干；

(7)加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

(8)溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；

(9)洗滌：揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復多次并拍干；

(10)顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；

(11)終止：每孔加終止液50μl，終止反應；

(12)測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度，在加終止液后15分鐘內進行。