[發(fā)明專利]一株可以調(diào)節(jié)人腸道菌群的益生菌及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210062066.4
• 申請日: 2012-03-09
• 公開（公告）號: CN102618459A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張佳超;王麗鳳;高鵬飛
• 申請（專利權(quán)）人: 北京和美科盛生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12R1/25;C12R1/01
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 李正清

1.一株可以調(diào)節(jié)人腸道菌群的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus?plantarum?P8)分離自內(nèi)蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號：CGMCC?No.5468，保藏日期為：2011年11月18日。

2.可以調(diào)節(jié)人腸道菌群的益生菌的檢測方法，其特征是包括下列步驟：

(1)糞便樣品中宏基因組DNA的提取：

采用液氮凍融-CTAB法：取1.0g糞便樣品洗滌處理，將洗脫的菌體于1.5mL離心管中，立即置于液氮中完全凍結(jié)，取出后放入65℃水浴中融化，反復(fù)凍融3次，加0.1mL?10％SDS和10.0μL?10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒溫?fù)u床中200r/min搖動2h，室溫下12000g離心10min，收集上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；上清液與等體積的氯仿于12000g離心10min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中進(jìn)行酚氯仿抽提2次，經(jīng)0.1倍體積的醋酸鈉，1倍體積的冰異丙醇沉淀總DNA，然后70％乙醇洗滌沉淀2次，回溶備用；

(2)腸道優(yōu)勢菌群特異性引物設(shè)計(jì)

針對雙歧桿菌屬，擬桿菌門，所裝菌屬和奇異菌屬設(shè)計(jì)合成四組特異性引物，菌體引物信息見下表：

擴(kuò)增體系：

反應(yīng)體系50μL：10×PCR?Buffer?5μL，25mmo1/L?Mg²⁺1.0μL，2.5mmol/LdNTPs?4μL，5mmol/L上下游引物各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL?Taq酶(Promega)0.5uL，dd?H₂O補(bǔ)足至50μL；

擴(kuò)增條件：

95℃變性5min；循環(huán)30次：95℃變性1min，退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存；

(3)瓊脂糖凝膠電泳

將PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20-30min，EB染色，紫外拍照，檢測擴(kuò)增效果；

(4)外標(biāo)準(zhǔn)品的制備

應(yīng)用特異性引物擴(kuò)增雙歧桿菌屬，擬桿菌屬，普拉梭菌屬和奇異菌屬的特異性片段，檢測后膠回收各自片段達(dá)到純化的目的；而后將純化的片段和pMD-19T載體連接，連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆子酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證過的陽性克隆子提取質(zhì)粒，測定濃度后計(jì)算拷貝數(shù)作為外標(biāo)準(zhǔn)品以供后續(xù)試驗(yàn)未知樣品中該菌屬的定量使用；

(5)RT-PCR檢測樣品中各個優(yōu)勢菌屬的數(shù)量

首先應(yīng)用上述外標(biāo)準(zhǔn)品制作各個菌屬的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增曲線，然后以標(biāo)準(zhǔn)曲線為依據(jù)，用各個菌屬的特異性引物定量檢測樣品中雙歧桿菌屬，擬桿菌屬，普拉梭菌屬和奇異菌屬的數(shù)量；

RT-PCR擴(kuò)增體系：

反應(yīng)體系20μL：10×PCR?mix?10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd?H₂O補(bǔ)足至20μL；

RT-PCR擴(kuò)增條件：

95℃變性20s；循環(huán)40次：95℃變性5s，退火30s，72℃延伸35s。