[發明專利]分離的二酰甘油酰基轉移酶基因，其表達載體及應用

無效

• 申請號: 201210059920.1
• 申請日: 2012-03-08
• 公開（公告）號: CN102634528A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 侯磊;裴炎;梁愛敏;周慶璋;張丹丹;李先碧;宋水清;李德謀;張瑞芝;肖月華;羅明;金丹;羅小英
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/63;C12N15/81;C12N15/82;C12N15/84;C12N1/19;A01H5/00;A01H5/10
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及轉移酶基因、含有該基因的酵母表達載體和植物表達載體，以及這些表達載體的轉化體。本發明還涉及上述基因在植物性狀改良上的應用。

背景技術

傳統化石能源緊缺，將使生物柴油和燃料乙醇逐步替代石油，發展成為新的基礎產業和新的能源產業，以滿足人類在后石油時代對液體能源的大量需求。生物柴油是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及動物油脂、餐飲垃圾油等為原料油通過酯交換工藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，與傳統的柴油相比，具有能量密度高、潤滑性能好、儲運安全、抗爆性好、燃燒充分等優良性能，是最具發展潛力的大宗生物基液體燃料。植物油含有豐富的還原態碳鏈，是同體積淀粉所含能量的8倍多。植物油不僅是人類營養需求的重要食用油，而且已經成為許多化工產品的重要環保原料，廣泛應用于肥皂、清潔劑、潤滑劑以及油漆等的生產。更重要的是植物脂肪酸還可作為生物柴油的原料。因此，利用基因工程技術，提高植物或油料作物中油脂含量，不僅對于應對日益嚴峻的能源形勢，舒緩能源消費結構矛盾；同時，對于改善人類使用油的質量，調整農業產業結構和增加農民收入，都具有重大的意義。

植物種子中的貯藏物質主要有淀粉、蛋白質和脂類。植物種子中儲存的脂肪酸常以三酰甘油酯(TAGs)，即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式存在。而脂肪酸成分主要是16至18碳或含一至三個雙鍵的脂肪酸，如硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等。脂肪酸代謝主要是在質體和內質網中進行的，首先，合成脂肪酸的碳源主要是蔗糖，在種子中通過糖酵解途徑將其轉變成己糖，并氧化成乙酰CoA(乙酰輔酶A)。而TAG合成的骨架成分甘油3-磷酸也是通過糖酵解的中間產物合成的。隨后，在質體中經乙酰CoA羧化酶(ACC)將乙酰CoA合成為丙二酰單酰CoA。然后脂肪酸合成酶復合物(FAS)以丙二酸單酰CoA為底物進行連續的聚合反應，經過數次循環聚合反應后，脂肪酸的合成可在酰基-ACP硫酯酶或酰基轉移酶的作用下終止。而終止聚合后的不同碳鏈長度的酰基ACP，在酰基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA，并從質體轉運到內質網或胞質中。最后利用貯存在胞質中的酰基CoA池，在內質網上通過三種不同的酰基轉移酶，即甘油3-磷酸酰基轉移酶(G3P-AT)、溶磷脂酸酰基轉移酶(LPA-AT)和二酰甘油酰基轉移酶(acyl?CoA：diacylglycerol?acyltransferase，DGAT)，分別在甘油上連接脂肪酸以合成三酰甘油酯和結構磷脂(Cahoon等，Curr?Opin?Plant?Biol.2007，10：236-44)。

目前的研究證明，要提高種子中的油脂含量，不僅需要增加游離酰基CoA的含量，更重要的是需要增加貯藏型的三酰甘油酯(TAGs)在種子中的含量。前人的研究(Shockey等，Plant?Cell?2006，18：2294-2313；Kroon等，Phytochemistry2006，67：1166-1176)發現，在發育的種子中，DGAT催化酰基CoA和二酰甘油酯合成TGA的最后一步，雖然對于多種酰基轉移酶之間的相互作用不清楚，但DGAT在油脂的合成中為關鍵限速步驟，直接影響種子中TAG的含量和成分已經明確。已經從蓖麻、擬南芥和花生等植物中克隆了編碼DGAT的基因，包括DGAT1和DGAT2以及可溶性的DGAT3。Jako等(Plant?Physiol?2001，126：861-874)在擬南芥種子中特異超表達DGAT基因，不僅增加了種子重量，而且增加了種子含油量，表明在植物種子特異表達DGAT基因是能夠提高油脂含量的。

但是，并不是所有在植物中表達的DGAT基因都能提高油脂含量(Oakes等，Plant?Physiology?2011，155：1146-1157)，這主要取決于DGAT基因的來源與類型。我們從微生物中克隆了幾種不同的DGAT基因，來源酵母中克隆脂肪酸合成相關的DGAT基因，并將其導入釀酒酵母和煙草中，在種子中特異超表達以增加種子貯藏TGA的合成，最終達到提高植物種子種含油量的目的，從而在農業生產中創造更大的經濟效益和社會效益。

發明內容

本發明的目的在于提供一種分離的二酰甘油酰基轉移酶基因，其具有SEQID?NO.1所示的核苷酸序列(1563bp，其中第1561-1563位bp為終止密碼子)，將所述二酰甘油酰基轉移酶基因構建成表達載體，應用于植物的性狀改良中，能有效地提高植物種子的油脂含量。

本發明的所述的分離的二酰甘油酰基轉移酶基因編碼具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列(520aa)。