[發明專利]一種脂肪酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201210059320.5
• 申請日: 2012-03-08
• 公開（公告）號: CN103305489A
• 公開（公告）日: 2013-09-18
• 發明（設計）人: 周志剛;何夙旭;徐俐;楊雅麟;張美超;張宇婷;任鵬飛;姚斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院飼料研究所
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種脂肪酶及其編碼基因與應用。

背景技術

飼料油脂來源問題已成為水產飼料配制的瓶頸問題。近年來，由于油脂價格不斷攀升(魚油從2005年8000元/噸上漲到2011年12000元/噸，豆油從2005年5000元/噸上漲到2011年10000元/噸，分別上漲50％與100％)，水產飼料企業不得不大量使用廉價油脂(如米糠、棕櫚油、椰子油等)，但廉價油脂負面效應突出：油脂氧化、魚體脂肪肝、代謝紊亂、魚肉品質下降、水體環境污染等問題。從生物工程角度來解決這一水產實踐問題(讓廉價油脂高效化)變得緊迫且可行。

水產外源脂肪酶的添加可創造解決上述問題。脂肪酶是動物體內的一種重要消化酶，主要分解飼料中的甘油三脂、磷脂和甾類化合物。腸道是魚類消化脂肪的主要部位，但是由于以下因素導致魚類內源性脂肪酶效率的下降，也由此限制了其它廉價油脂添加：①水溫，水產動物對脂肪的消化在水溫18-25℃時最佳，而低于18℃或者高于25℃時，則消化率明顯下降；②脂肪不飽和度，不飽和雙鍵越多則越難以消化利用；③脂肪鏈長，無論是冷水魚還是溫水魚添加飽和脂肪的效果均很差，在同樣數目不飽和鍵的情況下，脂肪酸長度越長，消化率越往下降。

水產飼用脂肪酶已有報道，添加優勢在于：①提高飼用油脂的利用率，改善飼料香味和風味，促進動物食欲，降低脂肪肝發病率；②節約蛋白質(3-5％水平)和多不飽和脂肪酸的添加水平，從而最大限度利用廉價油脂，間接降低氮、磷排泄量，減少環境污染；③酶解釋放的中鏈脂肪酸能抑制腸道有害菌群，并對腸道局部炎癥有一定療效(類抗生素效應)。

現有商業化脂肪酶存在缺陷：①商品化的脂肪酶不適用于水產飼料用，在pH穩定性、最適pH、最適溫度上存在不足。②表達量及比活低，大多介于100-2000U/μg酶活表達量，導致添加成本高，限制了工業化應用。

水產飼用脂肪酶市場前景廣闊。2010年我國水產配合飼料產量達1500萬噸規模，其中油脂消耗量(按平均2％添加)達30萬噸/年，如能找到水產飼用脂肪酶的話按市場規模3000噸/年(按0.2kg酶制劑/噸添加)，按市場占有率20％，可節約油脂1.2萬噸，節約飼料成本100元/噸，大幅提高養殖效益，因此具有重大意義。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種蛋白。

本發明提供的蛋白，是如下(a)或(b)或(c)的蛋白質：

(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(b)序列表中序列2的自N末端第21-408位氨基酸序列組成的蛋白質；

(c)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶功能的由(a)或(b)衍生的蛋白質。

上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白的編碼基因也是本發明保護的范圍。

上述編碼基因為如下1)-4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中的序列1所示的DNA分子；

2)序列表中的序列1自5’末端第61-1224位核苷酸所示的DNA分子；

3)在嚴格條件下可與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有脂肪酶功能所述蛋白的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且編碼具有脂肪酶功能所述蛋白的DNA分子。

上述嚴格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃條件下雜交并洗膜。

含有上述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的范圍。

上述重組載體為在pET-28載體的EcoR?I和Not?I酶切位點間插入上述蛋白的編碼基因得到的重組載體。

上述重組菌是將上述的重組載體導入到大腸桿菌BL21中得到的重組菌。

本發明的另一個目的是提供一種引物對。

本發明提供的引物對，由序列表中的序列3所示的引物1和序列表中的序列4所示的引物2組成。

上述引物對用于擴增上述編碼基因的全長或其任一片段。

上述的蛋白作為脂肪酶的應用也是本發明保護的范圍。

上述應用中，所述脂肪酶具有如下1)-6)中至少一種性質：

1)耐受有機溶劑，所述有機溶劑進一步具體為甲醇、乙醇、甘油或正庚烷；