[發(fā)明專利]瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒及其制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210058427.8
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102590522A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張國華
• 申請（專利權(quán)）人: 上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測用試劑盒，具體涉及一種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒及其制備。

背景技術(shù)

瘧疾(Malaria)是由熱帶、亞熱帶的一種蚊叮咬傳播瘧原蟲而引起的，不同的瘧原蟲分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。本病主要表現(xiàn)為周期性規(guī)律發(fā)作，全身發(fā)冷、發(fā)熱、多汗，長期多次發(fā)作后，可引起貧血和脾腫大。瘧疾于夏秋季發(fā)病較多，在熱帶及亞熱帶地區(qū)一年四季都可以發(fā)病，并且容易流行。在亞洲和非洲地區(qū)瘧疾仍然是威脅和危害人們健康最為嚴(yán)重的寄生蟲疾病之一。目前，全球仍有1.2億瘧疾患者，帶蟲者約3億，非洲每年還有百萬兒童死于瘧疾。

富組蛋白(HRP-II)是惡性瘧原蟲消化血紅蛋白后形成的代謝產(chǎn)物，由血液期無性體和早期配子體合成，含有大量組氨酸，具有種特異性，由于是水溶性抗原其可在瘧疾患者的血漿、尿、全血中檢測到，是診斷惡性虐的理想靶位；瘧原蟲乳酸脫氫酶(pLDH)是瘧原蟲體內(nèi)代謝酶，紅內(nèi)期瘧原蟲無性期和配子體期均有表達(dá)，其物理生化、免疫學(xué)特性、酶催化作用等與人體紅細(xì)胞和其他許多微生物的乳酸脫氫酶差異性大，可以作為免疫診斷的靶抗原。

目前診斷瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)仍是傳統(tǒng)的血膜染色鏡檢法，且作為瘧疾確診最重要的標(biāo)準(zhǔn)。該法是用普通手動(dòng)移片和對焦的生物顯微鏡，鏡檢人員常因眼睛疲勞而導(dǎo)致讀片準(zhǔn)確性降低、工作效率低。以納米膠體金為標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)發(fā)展很成熟，但現(xiàn)有的瘧疾檢測試劑盒采用的單克隆抗體只能檢測一種抗原，或者是將幾種抗體簡單結(jié)合于檢測區(qū)，增加了生產(chǎn)的復(fù)雜度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種含雙特異性單克隆抗體的瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，實(shí)現(xiàn)瘧疾(Malaria)的靈敏、特異、快速的檢測。

本發(fā)明首先提供了一種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，免疫膠體金紙片上包被有膠體金標(biāo)記的HRP?II-pLDH雙特異性單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)噴點(diǎn)有抗HRP?II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。

較佳的，所述膠體金標(biāo)記的HRPII-pLDH雙特異性單克隆抗體中，膠體金為粒徑39-42nm的球形顆粒。

本發(fā)明的另一方面，提供了這種瘧原蟲抗體膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

1)用兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金；

2)采用步驟1制得的膠體金標(biāo)記HRP?II-pLDH雙特異性單克隆抗體獲得免疫膠體金；

3)采用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的玻璃纖維墊片，制得免疫膠體金紙片；

4)在硝酸纖維素膜的檢測線噴點(diǎn)抗HRP?II特異性單克隆抗體和抗pLDH特異性單克隆抗體的混合液，在質(zhì)控線上噴點(diǎn)羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；

5)將濾樣紙、步驟3制備的免疫膠體金紙片、步驟4制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條；最后將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。

步驟1)所述兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金具體包括下列步驟：

a)第一次還原氯金酸溶液：

制備濃度為0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl₄與檸檬酸三鈉的摩爾比為1∶(8-9)，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，既制得14～16nm粒徑的膠體金原溶液。

b)第二次還原氯金酸溶液：

將第一步制得的膠體金原溶液放置于4.0-4.5℃恒溫冰浴中穩(wěn)定溫度，隨后按膠體金原溶液與HAuCl₄水溶液體積比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L?HAuCl₄水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4.0-4.5℃的抗壞血酸與PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl₄的摩爾比為(25-26)∶1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl₄的重量比為1∶(2.0-2.1)，反應(yīng)中保持溫度恒定，攪拌至反應(yīng)完全，溶液呈透明的酒紅色，既制得39-42nm粒徑的膠體金溶液。

兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。