[發明專利]控制水稻育性的基因及其編碼蛋白和應用

有效

• 申請號: 201210057952.8
• 申請日: 2012-03-07
• 公開（公告）號: CN102634522A
• 公開（公告）日: 2012-08-15
• 發明（設計）人: 李仕貴;欽鵬;王玉平;涂兵;馬炳田;鄧路長
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/63;C12N1/21;A01H5/00;C12N15/84;C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 胡長遠

1.一種控制水稻育性的基因，其特征在于由下述(1)或(2)組成：

(1)由SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列組成；

(2)由SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列經過插入、缺失或替代一個或多個堿基，與SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且編碼與(1)相同功能蛋白質的核苷酸序列組成。

2.編碼權利要求1所述的控制水稻育性的基因的蛋白質，其特征在于是下述(1)或(2)的蛋白質：

(1)由SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列組成；

(2)將SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且與控制水稻育性相關的氨基酸序列組成。

3.一個水稻單隱性雄性不育基因，其特征在于由下述(1)或(2)組成：

(1)由SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列組成；

(2)由SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列經過插入、缺失或替代一個或多個堿基，與SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且編碼與(1)相同雄性不育功能的核苷酸序列組成。

4.含有權利要求3所述的水稻單隱性核不育基因的表達載體、宿主細胞或植物。

5.按照權利要求4所述的表達載體，其特征在于所述的載體是指pCambia1300，pCambia1301或pOsact2；所述的宿主細胞是指農桿菌或大腸桿菌；所述的植物是指水稻、玉米、小麥，油菜、大豆、短柄草或擬南芥。

6.利用RNAi技術控制權利要求1所述的水稻育性基因的表達獲得水稻不育系的方法，包括如下步驟：

(1)以正常可育的水稻品種的cDNA為模板，以ASABCG15-F和ASABCG15-R為引物進行PCR擴增，獲得493bp的PCR擴增產物，命名為ASABCG15；所述的引物為由SEQ?ID?No：4和SEQ?ID?No：5所示的核苷酸序列；所述的PCR反應體系為：cDNA?3μL，dNTP?5μL，10XPCR緩沖液5μL，25mM?Mg²⁺2μL，引物10μM?1.5μL；KOD-plus-NEO酶1.5μL；DMSO?1.5μL；H₂O?30.5μL；所述的PCR的反應條件：94℃2min；98℃10s，68℃30s，35個循環；72℃10min，10℃1min；

(2)回收PCR擴增產物，并將PCR擴增產物與載體PMD20連接，得連接產物；將連接產物轉化至宿主細胞，37℃過夜培養；然后挑取單菌至LB液體培養基過夜培養；提取質粒，然后檢測陽性質粒，并對質粒中的插入序列進行測序，確認插入序列為ASABCG15序列，得到PMD20-ASABCG15載體；將PMD20-ASABCG15載體和pOsAct2-nos載體同時用Kpn?I和EcoR?I進行雙酶切，將酶切產物回收，連接、轉化，構建成pOsAct2-ASABCG15載體；將pOsAct2-ASABCG15載體通過農桿菌轉化到EHA105菌株，轉化后所得菌株命名為EHA105-pOsAct2-ASABCG15；

(2)培育水稻愈傷組織，將EHA105-pOsAct2-ASABCG15通過農桿菌介導轉化的方法轉化進水稻愈傷組織中，然后利用潮霉素基因對轉基因苗進行陽性檢測，并且對ABCG15的RNA表達量進行檢測，選擇表現完全雄性不育、且檢測不到ABCG15表達量的植株，即為通過RNAi技術得到的水稻雄性核不育材料。

7.用于擴增產生反義RNA的DNA片段的一對PCR引物，其特征在于所述的引物由SEQ?ID?No：4和SEQ?ID?No：5所示的核苷酸序列組成。

8.用于檢測權利要求1所述的控制水稻育性基因的RNA表達量的PCR引物，其特征在于所述的引物由SEQ?ID?No：14和SEQ?ID?No：15所示的核苷酸序列組成。

9.用于產生反義RNA的DNA片段，其特征在于所述的DNA片段由SEQ?IDNo：16所示的核苷酸序列組成。

10.權利要求1所述的水稻控制育性的基因在培育水稻單隱性核不育系上的應用。