[發(fā)明專利]一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210057485.9
• 申請(qǐng)日: 2012-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN102586449A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)N薇;王樂;楊富裕;毛培勝;于曉丹;劉斯佳;李洪超
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于牧草種質(zhì)資源鑒定領(lǐng)域，具體涉及一種利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定牧草的方法。

背景技術(shù)

狼尾草屬(Pennisetum?Rich.)牧草為一年生或多年生禾本科牧草，是優(yōu)質(zhì)的牧草資源。其中象草(P.purpureum)具有高產(chǎn)、營養(yǎng)價(jià)值豐富并喜高溫多雨等特點(diǎn)，美洲狼尾草(P.americanum)品質(zhì)優(yōu)，適口性好，美洲狼尾草(父本)與象草(母本)的種間三倍體雜種雜交狼尾草兼具父本與母本的優(yōu)點(diǎn)，并有適應(yīng)性強(qiáng)、供草期長(zhǎng)的特點(diǎn)，作為草食動(dòng)物優(yōu)良的青飼料，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用。隨著研究的深入，優(yōu)質(zhì)狼尾草的引種和選育就顯得越來越重要，然而由于狼尾草屬種內(nèi)種間反復(fù)雜交，導(dǎo)致遺傳分化越來越多樣，新老品種繁多，品種間的形態(tài)學(xué)差異越來越小，且不同地域經(jīng)常交換，造成同名異物或同物異名現(xiàn)象，單靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法已經(jīng)很難區(qū)分如此眾多的品種，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，從DNA分子的角度準(zhǔn)確可靠地對(duì)品種進(jìn)行基因鑒定成為可能，現(xiàn)階段已被廣泛應(yīng)用。

DNA分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記——形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，分子標(biāo)記具有較多的優(yōu)越性：在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；不受外界環(huán)境影響；大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，有利于選擇隱性性狀；分子標(biāo)記揭示來自DNA的變異；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于物種品種鑒定、親緣關(guān)系鑒別、遺傳育種、基因定位、基因克隆等方面。

ISSR(Inter-Simple?Sequence?Repeats，簡(jiǎn)單序列重復(fù))分子標(biāo)記是Zietkeiwitcz等于1994年發(fā)展起來的，屬于DNA分子標(biāo)記技術(shù)的一種。其基本原理是：利用生物基因組中廣泛存在的簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR(Simple?Sequence?Repeat)設(shè)計(jì)引物，無需預(yù)先克隆和測(cè)序，在PCR反應(yīng)中，對(duì)與引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。所擴(kuò)增的Inter?SSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳得以分辨。與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可在不同種間通用，不像SSR標(biāo)記引物具有較強(qiáng)的種特異性；與RAPD標(biāo)記相比，穩(wěn)定性高，獲得的信息量大；與PFLP相比，具有檢測(cè)方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。

由于ISSR分子標(biāo)記快速、簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好，并且ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性高，因此可用于植物品種鑒定。ISSR-PCR可擴(kuò)增出大量特異性DNA片段，這些特異性片段的組合可作為某一品種區(qū)別于其他品種的獨(dú)特標(biāo)記，也有人稱之為“指紋”。通過檢測(cè)樣品是否具有特有的“指紋”，可以有效的進(jìn)行品種鑒定。Charter利用ISSR分子標(biāo)記區(qū)分鑒定了可可豆種質(zhì)，魏臻武在苜蓿基因組ISSR分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了苜蓿基因組DNA指紋圖譜，作為苜蓿品種鑒定的依據(jù)。但至今國內(nèi)外未見應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記方法區(qū)分鑒定狼尾草屬牧草的報(bào)道。狼尾草屬牧草種子和幼苗形態(tài)相近，不易區(qū)分，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記方法鑒定狼尾草屬牧草，一方面可彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足，另一方面可促進(jìn)引種、選育過程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定狼尾草屬牧草的方法，其中ISSR-PCR所用的引物為UBC815和UBC835其核苷酸序列分別為：

UBC815-CTCTCTCTCTCTCTCTG；

UBC835-AGAGAGAGAGAGAGYC。

所述ISSR分子標(biāo)記所用引物還可包括UBC817或UBC843，其核苷酸序列分別為：

UBC817-CACACACACACACACAA；

UBC843-CTCTCTCTCTCTCTCTRA。

所述鑒定方法的具體步驟為：

(1)提取狼尾草屬DNA，構(gòu)建DNA池；

(2)利用ISSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增狼尾草屬DNA；

(3)構(gòu)建狼尾草屬DNA電泳模式圖；。

(4)鑒定狼尾草屬牧草。