[發(fā)明專利]馬動脈炎病毒的RT-LAMP檢測試劑及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210056298.9
• 申請日: 2012-03-06
• 公開（公告）號: CN102605101A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃素文;于紀(jì)棉;郭巍;戚亭;王建峰;倪健波;楊文潮;李如松;張超;章勝喬;相文華
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及馬動脈炎病毒的檢測技術(shù)，具體涉及馬動脈炎病毒的RT-LAMP檢測試劑及試劑盒。

背景技術(shù)

馬病毒性動脈炎是由馬動脈炎病毒(Equine?viral?arteritis，EVA)引起的一種通過呼吸道或生殖器官傳播的傳染病，是危害養(yǎng)馬業(yè)的重大疾病之一，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列入檢疫名錄。馬動脈炎病毒(EAV)屬于套式病毒目(?Nidovirale)?、動脈炎病毒科(?Arteri-?-viridae)、動脈炎病毒屬(?Arterivirus)?，它是線性單股正鏈RNA病毒，含有至少9個以上重疊的開放閱讀框架，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白：小囊膜蛋白(E、GP2b、GP3和GP4)、核衣殼蛋白(N)、膜基質(zhì)蛋白(M)、主要囊膜蛋白GP5。1957年Doll等在美國俄亥俄州Bucyrus首次分離到該病毒，目前分布遍及全世界，多數(shù)為亞臨床感染，但良種馬易發(fā)病。病毒只有1個血清型，有歐、美兩個代表株，歐洲株為CW株，美洲株為Bucyrus株。近年來，我國社會經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展和人們生活水平不斷提高，喜愛養(yǎng)馬和賽馬的人也越來越多，隨著馬術(shù)比賽國際化交流日益增多，該病的傳播風(fēng)險也越來越高。為防治該病的傳播，有必要建立一種快速、高效、操作簡便的檢測方法。

目前EVA的檢測方法主要有病毒中和試驗(yàn)、病原鑒定、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA、）和RT-PCR檢測等，其中病毒中和試驗(yàn)和病原鑒定（僅限于精液）是OIE國際貿(mào)易指定試驗(yàn)方法，授權(quán)公告號為CN1851463的發(fā)明專利，則公開了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測EAV方法，RT-PCR檢測如杜建等的馬動脈炎病毒RT-PCR檢測方法的建立（中國動物檢疫,?2005,(5):30-32）；但上述方法均存在不同的缺點(diǎn)，例如，所需試驗(yàn)周期較長、對儀器要求要求高、操作繁瑣、無法現(xiàn)場檢測，且靈敏度不高、特異性不強(qiáng)、準(zhǔn)確性較低、易受檢測材料限制等。研究建立特異、敏感、可對馬病毒性動脈炎病毒進(jìn)行方便、準(zhǔn)確檢測的方法，在檢疫方面具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了馬動脈炎病毒的RT-LAMP檢測試劑及試劑盒，該RT-LAMP檢測試劑及試劑盒具有高靈敏度、高特異性、操作簡單、對儀器要求簡單和結(jié)果易于觀察等優(yōu)點(diǎn)，方便適用于現(xiàn)場快速檢測；為馬病毒性動脈炎的早期防治提供技術(shù)支持。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：馬動脈炎病毒的RT-LAMP檢測試劑，包括F3引物溶液、B3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液，所述F3引物溶液含核苷酸序列為：GCCTCGTCTT?CGGTCCAT的F3引物，所述B3引物溶液含核苷酸序列為：CGCCCGTTTC?GAAAAGAGG的B3引物，所述BIP引物溶液含核苷酸序列為：TTGAGCGGGG?GATGGGAACA?CATCGCCAAC?TGGTGGTAG的BIP引物，?所述FIP引物溶液含核苷酸序列為：ACTCAGATAG?TGGTTCGCGG?CGTCTTGACG?CCATCGACAA?G的FIP引物。

引物系選擇馬動脈炎病毒膜蛋白M基因的保守片段為靶目標(biāo)，應(yīng)用PrimerExploer?V4?軟件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)?分析、設(shè)計(jì)和合成；將合成的多組內(nèi)外引物最佳配對篩選實(shí)驗(yàn)，得到最合適的上述F3、?B3、BIP?、FIP引物；引物由上海生工合成。

該RT-LAMP檢測試劑組成100×25μl?反應(yīng)體系的試劑盒：10×ThermoPol?緩沖液?2.5μl，濃度8?U?/μL?的Bst?DNA?聚合酶1μl，濃度2.5mM的dNTP?2μl，濃度5?M的甜菜堿（Betaine）2μl?，濃度25?mM的MgCl₂1μl?，濃度都為10μM的F3引物溶液和B3引物溶液各0.5μl，濃度都為10μM的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4μl。25μl檢測反應(yīng)體系時樣品DNA模板2μl，余量用雙蒸水補(bǔ)足。ThermoPol緩沖液、dNTP液、Bst?DNA?聚合酶液和Betaine均購于TaKaRa公司。

該RT-LAMP檢測試劑組成的試劑盒中還可以有陽性對照液和陰性對照液，陽性對照液含有馬動脈炎病毒陽性cDNA，陰性對照液為雙蒸水，用以對比、驗(yàn)證檢測。