[發明專利]重組HPV16L2蛋白疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201210054370.4
• 申請日: 2012-03-05
• 公開（公告）號: CN102614506A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發明（設計）人: 曾毅;周玉柏;郭艷濤;李澤琳
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20;A61P35/00;C12N15/70;C07K19/00;C07K14/025
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李桂玲;孔祥玲

技術領域

本發明屬于重組蛋白制備領域，涉及重組HPV16L2蛋白疫苗及其制備方法，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2?Ne）和具有穿膜活性的轉導域多肽（PTD）。

背景技術

人乳頭狀瘤病毒（Human?papillomavirus，HPV）屬乳多空病毒科，是無包膜的閉環雙鏈DNA病毒。現已明確，高危型HPV如HPV16、18的持續感染與宮頸癌的發生密切相關，被確定為導致宮頸癌的主要病因，其中又以HPV16型最為常見（Bosch?F?X,?J?Natl?Cancer?Inst?,1995?,87:?796–802.）。

中國專利“人宮頸癌的一種治療性疫苗（專利號：ZL200810112765.9）”中，公開了人宮頸癌的治療性的疫苗，該疫苗的活性成分為重組腺病毒，該疫苗是將包括HPV16mE67、HPV18mE67、HPV58mE67以及連接三者的短核苷酸片段的轉錄融合三基因片段插入Adeno-X的表達系統的病毒DNA中得到重組腺病毒載體，再將該腺病毒載體導入細胞中得到重組腺病毒。該治療性疫苗雖然能引起宿主產生強烈的細胞和體液免疫反應，但以前的感染可能對疫苗的效果產生負面影響。

HPV16病毒樣顆粒（Virus-Like?Particles）由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2一起共同構成。研究表明，主要衣殼蛋白L1可以自組裝形成病毒樣顆粒結構（Virus?Like?Particles，VLPs），L1?VLPs可誘導機體產生高滴度的血清中和抗體，該抗體具有型別特異性，不同基因型的HPV?L1?VLPs?之間沒有或僅有微弱的交叉保護效果。近來的研究顯示，不同型別HPV?L1?VLPs的混合制劑在免疫時相互之間會產生競爭，導致疫苗整體免疫效果的下降(Ting?Zhang,Vaccine,?2010,?28(19):3479-3487)且多個VLPs的混合制劑增加了接種蛋白劑量，加大了疫苗接種個體過敏的幾率。大量的實驗證實，HPV16L2蛋白的N端具有中和多種HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候選宮頸癌疫苗（Kawana?K，Virology,1998,245:353-359），然而，其免疫原性偏低制約了該疫苗的進一步應用。因此，提高HPV16L2蛋白免疫原性是決定該疫苗能否進入實用化階段的重要因素。源于HIV-1?Tat的轉導域多肽具有穿膜活性，可以將外源蛋白（融合或非融合）帶入細胞內。有研究顯示，轉導域多肽可顯著提高外源蛋白進入胞內的水平（Haibin?Xia,?Nature?Biotechnology,2001,?19:?640-644）。

因此，在宮頸癌疫苗的領域，需要研發出一種將轉導域多肽PTD的穿膜活性與HPV16L2蛋白的免疫原性協同作用，顯著提高HPV16L2蛋白免疫原性的新型重組蛋白疫苗。

發明內容

本發明的目的在于提供重組HPV16L2蛋白疫苗及其制備方法；該重組HPV16L2蛋白疫苗將轉導域多肽PTD的穿膜活性與HPV16L2蛋白的免疫原性協同作用，免疫原性較高。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

重組HPV16L2蛋白疫苗，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2?Ne）和具有穿膜活性的轉導域多肽（PTD）。

進一步地，所述HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2Ne）是HPV16L2?1-88aa多肽片段或HPV16L2?1-200aa多肽片段；編碼所述的HPV16L2?1-88aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQ?ID?No：1；編碼所述的HPV16L2?1-200aa多肽片段的核苷酸序列為序列表中的SEQ?ID?No：2。

進一步地，編碼所述的具有穿膜活性的轉導域多肽（PTD）的核苷酸序列為序列表中的SEQ?ID?No：3；所述的具有穿膜活性的轉導域多肽（PTD）的氨基酸序列為序列表中的SEQ?ID?No：4。

進一步地，該蛋白疫苗有兩種形式：一種為HPV16L2Ne?-PTD融合蛋白；一種為HPV16L2Ne蛋白和PTD蛋白按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。?

圖1為重組HPV16L2蛋白疫苗基因的結構模式圖。

本發明的目的是通過以下另一技術方案實現的：

重組HPV16L2蛋白疫苗的制備方法，該蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2?Ne）和具有穿膜活性的轉導域多肽（PTD）；制備方法包括如下步驟：