[發明專利]一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌新型隱球酵母tsp2-1Δ

無效

• 申請號: 201210054135.7
• 申請日: 2012-03-05
• 公開（公告）號: CN102586126A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 朱旭東;李中明;潘皎;孫智雄
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N9/02;C12R1/645
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域。具體涉及一株能產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌新型隱球酵母(Cryptococcus?neoformans)。?

背景技術

漆酶(EC?1.10.3.2)是一類含銅的藍色酚氧化酶。漆酶可以氧化一系列芳香族化合物，氧作為電子受體，副產物是水，因此是一種環保型酵素。?

漆酶廣泛分布于昆蟲、植物、真菌和細菌中。Yoshida首先在漆樹中發現了漆酶，一直以來，漆酶受到了科學界的廣泛關注，并且在工業生產和環境治理領域得到了廣泛的應用。目前，工業上應用的漆酶主要來源于真菌，例如，白腐菌產生的漆酶可用于木質素降解，紡織品漂白和食物處理等，漆酶還可用于環境污染物降解和土壤有機物轉化，漆酶在降解木質纖維素產乙醇中也具有潛在的應用價值。真菌漆酶的工業發酵生產存在以下問題：大多數真菌的漆酶表達調控的分子機制不清楚，一些真菌漆酶的表達是組成型的，而另一些真菌漆酶的表達是誘導型的，在真菌的生長過程中漆酶的表達會受到碳源(比如葡萄糖)的抑制，在有些情況下，漆酶會在蛋白酶的作用下失活。?

發明內容

本發明的目的是克服漆酶表達的葡萄糖阻遏抑制問題，提供一株能在高濃度葡萄糖條件下漆酶高產的新菌株。?

本發明提供的能在高濃度葡萄糖條件下漆酶高產的新菌株是一株擔子菌屬的新型隱球酵母Cryptococcus?neoformans(該菌株是野生型菌株JEC21的基因TSP2-1定向敲除突變株，基因TSP2-1的GenBank編號CNJ00820。該菌株于2011年9月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，菌種保藏號CGMCC?No.5274，分類命名為新型隱球酵母Cryptococcus?neoformans)tsp2-1Δ。?

本發明菌株為國內外首次發現。新型隱球酵母可以產生大量的漆酶，含有2種漆酶基因LAC1和LAC2，LAC1是表達主要的漆酶活性，而LAC2不表達。?

新型隱球酵母的漆酶共價結合到細胞壁上，可以氧化酚底物(去甲腎上腺素等)產生黑色素。影響新型隱球酵母漆酶表達的因素包括：(1)銅離子可以誘導漆酶的表達；(2)高溫(37℃)抑制漆酶的活性；(3)葡萄糖抑制漆酶的表達，當葡萄糖耗盡后才起始LAC1的表達。?

本發明經過多年大量的深入研究，培養了一株擔子菌，該菌的漆酶表達不受葡萄糖抑制，可在高濃度葡萄糖條件下產生大量漆酶，解決了漆酶生產的葡萄糖阻遏抑制問題。?

本發明通過根癌農桿菌介導的高效轉化方法，以新型隱球酵母血清型D菌株JEC21?(MATα)作為野生型菌株，構建了新型隱球酵母的隨機突變文庫，從中篩選到了漆酶葡萄糖去抑制突變株LZM36。通過反向PCR得到了突變基因TSP2-1(GenBank編號CNJ00820)。通過定向敲除基因TSP2-1獲得了漆酶葡萄糖去抑制菌株tsp2-1Δ。通過RT-PCR和漆酶活性測定對菌株tsp2-1Δ的漆酶表達和活性做了詳細的分析和檢測。?

本發明利用分子生物學方法對漆酶葡萄糖去阻遏菌株tsp2-1Δ進行了基因突變鑒定、漆酶表達和漆酶活性分析。?

該菌株可用來在高濃度葡萄糖條件下生產酚氧化酶——漆酶。即在高濃度葡萄糖培養基中培養所述微生物菌株以使所述微生物細胞組成型表達漆酶。?

所述高葡萄糖培養基為2％葡萄糖Asn培養基g/L：天門冬酰胺1g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀3g，pH?5.1，固體培養基則補加20g瓊脂粉。?

培養是在需氧條件下，在500mL三角瓶中發酵培養，接種方式采用菌液的接種方式，溫度為28-30℃。?

本發明的優點和積極效果：?

本發明提供了一株產漆酶葡萄糖去阻遏擔子菌Cryptococcus?neoformans?tsp2-1Δ。在高濃度葡萄糖(2％)條件下，野生型菌株JEC21的漆酶表達受到抑制，而菌株tsp2-1Δ的漆酶組成型高表達。漆酶活性測定發現菌株tsp2-1Δ是野生型菌株JEC21的9.25倍。本發明解決了漆酶生產的葡萄糖阻遏問題。?

附圖說明

圖1是本發明提供的菌株tsp2-1Δ的黑色素合成；?

圖2是本發明提供的菌株tsp2-1Δ的DNA印跡雜交(Southern?Blot)；?

圖3是本發明提供的菌株tsp2-1Δ中LAC1的轉錄表達量。?