[發明專利]p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備方法及其在損傷中樞神經再生與功能恢復中的應用

無效

• 申請號: 201210053808.7
• 申請日: 2012-03-05
• 公開（公告）號: CN102586313A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 王永堂;魯秀敏;朱楓;黃鵬;伍亞民;龍在云
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學野戰外科研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K19/00;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18;A61K38/17;A61K47/48;A61P25/00
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 夏洪

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，特別涉及p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備及應用。

背景技術

中樞神經系統（Central?nervous?system,?CNS）損傷與修復一直是神經科學研究的熱點。發育神經生物學及大量移植修復實驗證實成年哺乳動物CNS損傷后不僅可再生而且由神經元固有的特性（Intrinsic?properties）和其所處的微環境（Environment?cues）決定，與周圍神經系統損傷后的成功再生相比，CNS再生失敗的主要原因是由于損傷微環境中多種再生抑制分子，如Nogo-A、MAG?(Myelin-associated?glycoprotein)和OMgp（Oligodendrocyte-myelin?glycoprotein）的存在。它們均能獨立通過Nogo-66?受體（Nogo-66?receptor，NgR）及其下游可能的信號通路參與神經再生的抑制作用。NgR是一種GPI（Glycosyl?phosphatidylinositol）錨定膜蛋白，本身無信號轉導能力，其下游分子的活化需要其協同受體（Co-receptor）的參與。研究表明中樞神經神經元p75神經營養素受體（p75?neurotrophin?receptor,?p75NTR）作為NgR的一個協同受體，可通過其細胞外域（Extracellular?domain,?ED）與NgR碳末端結合介導髓磷脂抑制物對軸突再生的抑制作用。目前雖然p75NTR抑制劑在體外可增強神經元突起的生長，但體內實驗卻仍未證實其能夠促進損傷中樞神經元的軸突再生及功能恢復。

研究表明，體外移植p75NTR高表達的雪旺細胞（Schwann?cells,?SCs），嗅鞘細胞（Olfactory?enshenthing?cells,?OECs），神經干細胞（Neural?stem?cells,?NSCs）等均可促進損傷脊髓的軸突再生和功能改善。盡管其作用機制目前尚不清楚，但它們有一個共同特點，即均高表達p75NTR。這些細胞表面高表達的p75NTR在移植于損傷脊髓后可能與再生環境中神經元的NgR-配體復合物發生相互作用，拮抗神經元的NgR信號通路，減少再生抑制分子的抑制效應，進而促進軸突的再生。但靠細胞培養移植治療脊髓損傷，過程相對復雜，培養成本較高，可操作性不強，很難形成大規模生產。

目前重組蛋白的表達體系主要有真核表達體系和原核表達體系。真核表達體系最常用的為酵母表達體系和哺乳動物細胞表達體系。盡管真核表達體系可產生具有天然立體結構的分泌型蛋白，但真核表達體系也有其致命的缺點。如酵母表達體系糖鏈與哺乳動物加工不一致，培養上清中糖濃度較高，部分蛋白產物易降解，表達量不可控；再如哺乳動物細胞表達系統表達量通常較低，穩定細胞系建立技術難度大，生產成本高，遠不能滿足未來藥物開發的需要。原核表達體系中最常用的為大腸桿菌（Escherichia?coli），其遺傳背景清楚，基因工程操作簡便，商品化表達載體種類齊全，表達效率高，更重要的是其生產成本低、周期短，適合大規模生產。盡管其表達的蛋白很難進行正確折疊，生物活性較低，但pET原核表達系統通過對載體及宿主的改進，該狀況已有較大改觀。

發明內容

本發明的目的是提供一種p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備方法，以提高p75NTR-ED-Fc融合蛋白的表達效率和生物活性。

本發明的另一目的是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白的新用途，具體講是提供p75NTR-ED-Fc融合蛋白在損傷中樞神經再生與功能恢復中的應用，以促進損傷中樞神經再生與功能恢復。

本發明所述p75NTR-ED-Fc融合蛋白的制備方法由以下步驟實現：

（1）p75NTR-ED-Fc原核表達載體的構建與鑒定

以真核表達載體pcDNA-p75NTR-ED-Fc質粒為模板，根據Genebank中編號為NM_002507.1的p75NTR核苷酸序列及編號為XM_002348257.1的IgG的Fc段核苷酸序列分別設計特異的p75NTR正向引物和半特異的p75NTR/Fc反向引物，并在引物兩端分別引入Kpn?I、Xho?I酶切位點及相應的保護堿基，經PCR擴增得到p75NTR-ED-Fc片段，引物序列如下：

Forward?primer:?5'?CGGGGTACCATGGGGGCAGGTGCCACC?3'

Kpn?I酶切位點