[發明專利]用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物、探針及其應用

無效

• 申請號: 201210053592.4
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102586442A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 路興波;張廣遠;孫紅煒;李凡;楊淑珂
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一種用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物，其特征在于：所述引物由上游引物和下游引物組成，其序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。

2.權利要求1所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物在定性檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162轉化事件中的應用。

3.權利要求1所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物在SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162轉化事件中的應用。

4.一種用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針，其特征在于：所述探針的序列如SEQ?ID?NO.3所示，探針的5′端連接一個熒光報告集團FAM，3′端連接有一個熒光淬滅集團Eclipse。

5.權利要求1所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的特異性引物及權利要求4所述的用于檢測轉基因玉米MIR162的熒光標記探針在TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162轉化事件中的應用。

6.一種定性檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162轉化事件的方法，其特征在于：步驟為：

(1)提取待檢測樣品的基因組DNA，并以此為模板，利用MIR162-F和MIR162-R引物組合進行PCR擴增；

(2)PCR擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產物；若存在擴增產物，則待檢測樣品中含有MIR162轉化事件；若不存在擴增產物，則待檢測樣品中不含有MIR162轉化事件。

7.一種SYBR?Green?I實時熒光定量PCR檢測玉米及其相關產品是否含有MIR162轉化事件的方法，其特征在于：步驟為：

(1)建立MIR162轉化體特異性引物的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的SYBR?Green?I實時熒光定量PCR標準曲線：

①提取轉基因玉米MIR162標準品基因組DNA進行梯度稀釋，然后向各稀釋液中加入MIR162轉化事件的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標準引物，進行擴增；

②擴增后，測定各稀釋液中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制MIR162轉化事件的定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的定量PCR標準曲線；

(2)提取待檢測樣品基因組DNA，得基因組DNA提取液，然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因的特異性引物，以及zSSIIb基因的國家標準引物，進行擴增；擴增后，測定基因組DNA提取液中相關熒光標記物的Ct值，然后根據上述繪制的MIR162基因的定量PCR標準曲線和zSSIIb基因的定量PCR標準曲線，計算出相應的拷貝數，則轉基因玉米MIR162基因的拷貝數與玉米內標準基因zSSIIb基因的拷貝數之比，即為待檢測樣品中轉基因玉米MIR162的百分含量。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)①和(2)中，擴增的參數如下：擴增反應體積為20uL，2×Premix?Ex?Taq(Rox)10uL，濃度為10umol/L的Forward?primer?0.4uL，濃度為10umol/L的Reverse?primer?0.4uL，ddH2O?8.2uL，DNA模板1uL；擴增反應條件：95℃10min預變性；95℃15s，50℃30s，72℃30s，在72℃收集熒光信號，共計40個循環。