[發明專利]氯霉素抗性溫控裂解質粒及其構建與在菌蛻制備中的應用

無效

• 申請號: 201210053572.7
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102586307A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 祝文興;安利國;楊桂文;袁金鐸
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N1/20
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明涉及一種質粒載體，特別涉及一種氯霉素抗性溫控裂解質粒及其構建方法，以及其在制備大腸桿菌菌蛻中的用途，屬于基因工程領域。

背景技術

細菌菌蛻(Bacterial?ghost)是革蘭氏陰性菌被噬菌體PhiX174的裂解蛋白E裂解后形成的完整細菌空殼，這種非變性的基因滅活方式使菌蛻保留了和活菌一樣的細菌胞膜結構和相關抗原蛋白，從而誘導機體的體液免疫和細胞免疫應答。菌蛻外膜的天然的高度保守結構PAMP(pathogen-associated?molecular?patterns)，例如：脂多糖、肽聚糖、CPG、菌毛等，能被免疫細胞通過模式識別受體識別，有效地被樹突狀細胞和巨噬細胞吞噬，并有效地促進樹突狀細胞的成熟和活化。菌蛻的這些生物學特點使其可直接作為疫苗使用，還可作為遞呈異源抗原的重組疫苗及作為DNA疫苗甚至藥物的遞送載體。另外，菌蛻可以通過發酵方式生產，且冷凍干燥的菌蛻在室溫下可長期保持，而不會造成效率的損失。

細菌菌蛻的形成是通過對噬菌體PhiX174的裂解基因E的嚴格表達調控實現的。裂解基因E可以受控于多個表達系統，如λpL/pR-cI857、LacPO-LacI^q(啟動與阻隔物)、P_Tol-xylS以及P_BAD-araC等，其中應用最廣泛的是在λpL/pR-c1857轉錄控制下實現基因的可控表達。基因E的可控表達介導的細菌裂解已經成功地應用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、霍亂弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎放射桿菌、流感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、遲鈍愛德華菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌等。應用范圍之廣說明只要將基因E裂解框引入到適當的載體中，E蛋白介導的裂解可能會在每種革蘭氏陰性菌中發生。

目前已經構建的基因E介導的裂解質粒多數利用氨芐青霉素作為抗性篩選標記，還有一些具有卡那霉素、四環素或慶大霉素抗性篩選標記。由于細菌耐藥性現象越來越常見，許多細菌對氨芐青霉素、卡那霉素等常用抗生素產生耐藥，無法利用這些抗生素作為篩選標記。但許多病原菌如副溶血性弧菌、霍亂弧菌、小腸結腸炎耶爾森菌、大腸桿菌O157、變形桿菌、沙門菌、志賀菌等均對氯霉素敏感，還有大多數水生生物病原菌如柱狀嗜纖維菌、柱狀粘纖維菌、熒光假單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、點狀氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌及魯克氏耶爾森氏菌等均對氯霉素敏感或者高度敏感。因此，利用氯霉素作為抗性篩選標記能使E蛋白介導的裂解應用到更廣泛的細菌菌株中。構建氯霉素抗性的溫控裂解質粒是許多病原菌能夠成功形成菌蛻的前提。

發明內容

針對上述現有技術，本發明提供了一種新的氯霉素抗性溫控裂解質粒，并提供了其構建方法，以及其在菌蛻制備中的應用。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat，由噬菌體PhiX174裂解基因E(如SEQ?No.3所示)、氯霉素乙酰轉移酶基因(cat，如SEQ?No.4所示)和原核溫控表達載體pBV220組成。

所述氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat的構建方法為：以噬菌體PhiX174?RFI?DNA為模板、SEQ?No.1和SEQ?No.2所示DNA為引物進行PCR擴增，獲得噬菌體PhiX174裂解基因E，然后將其與經EcoR?I和Pst?I雙酶切的pBV220載體連接，獲得溫控裂解質粒pBV-geneE；將質粒pLysS經Acc?II酶切，獲得1787bp的包含側翼調控序列的cat基因，然后用T4?DNA?ligase將cat基因與經Sca?I單酶切的pBV-geneE進行連接，獲得氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat。

所述氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat能夠用于制備菌蛻，具體應用方式舉例如下：將氯霉素抗性溫控裂解質粒pBV-geneE-cat電擊轉化到大腸桿菌感受態細胞中；電轉化后涂布含氯霉素的LB瓊脂平板，培養，通過菌落PCR鑒定轉化子；然后，將轉化成功的含pBV-geneE-cat的大腸桿菌單克隆接種于含氯霉素的LB液體培養基，振蕩培養，然后再轉接于含氯霉素的LB液體培養基中，振蕩培養至OD_600nm達0.4-0.6，將培養物迅速調至42℃培養以誘導E基因的表達，繼續培養，即得大腸桿菌菌蛻。