[發明專利]V5抗原表位融合性酵母表達載體及構建方法

無效

• 申請號: 201210053179.8
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102533843A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李湘鳴;羅方妮;葛宜枝
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/66
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于基因生物工程領域，具體涉及一種V5抗原表位融合性酵母表達載體及構建方法。

背景技術

酵母是最常用的基因生物工程宿主細胞，這是酵母是單細胞低等真核生物細胞，不僅具有易培養、繁殖、生長條件要求不高等特點外，而且具有遺傳背景清楚、基因結構、基因調控、代謝和蛋白質翻譯后加工與哺乳動物細胞相似等特點。所以，用酵母細胞表達外源性基因具有良好的發展應用前景。

驗證外源性基因在酵母中是否表達，通常是選用外源性基因表達產物的特異性抗體或通過測試外源性基因表達產物的功能來實現。但外源性基因種類很多，許多無特異性商品化抗體，即是有特異性抗體也較昂貴；通過外源性基因表達產物的生物功能進行驗證更加復雜，因為對外源性基因表達產物的生物功能有時難以建立方法進行驗證，即是建立了方法也較復雜，特別是難驗證某些新發現基因在酵母細胞中的表達更加困難。V5抗原是來自副黏液病毒猿猴病毒5的P和V蛋白的抗原表位，多由14個氨基酸(GlyLysProIleProAsnProLeuLeuGlyLeuAspSer?Thr)組成。V5抗原表位抗體為一種通用性抗體，目前已經商品化。

發明內容

為了解決目前驗證外源性基因在酵母細胞中的表達的困難，本發明提供了一種V5抗原表位融合性酵母表達載體，可以有效地解決外源性在酵母細胞表達的驗證問題。

本發明采用的技術方案是：

1)以Invitrogen公司的pYestrp2載體為基本框架，通過PCR方法從酵母基因組擴增酵母強啟動子GPD，并經Swa?I和BamH?I兩酶切位點，將其插入到pYestrp2載體中，構建成GPD驅動的酵母表達載體，命名為pGPD；

2)人工合成兩條V5抗原表位DNA單鏈，并分別在各單鏈的5′端增加BamHI和EcoR?I黏性末端(小寫所示)。為了能使V5抗原表位DNA能與下游基因相融合，同時在合成時，分別在正鏈的3′和反鏈5′端分別增設一個G和C(如下方框所示)，使V5抗原表位DNA通過柔性短肽Gly(甘氨酸)-Ile(異亮氨酸)-即GGA-ATT-與下游基因相融合。

人工合成的V5抗原表位(V5epitope)DNA：

正鏈為5′-gatccATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCTCGGTCTCGATTCTACAg-3′；

反鏈為5′-aattcTGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCTTACCCATg-3′；

3)將所合成的V5抗原表位DNA用退火緩沖配成5umol/L，等體積混合，常規退火形雙股，將插入到pGPD的相應酶切位點，構建成可與V5抗原表位相融合的酵母表達載體pGPDV5。

附圖說明

圖1本發明V5抗原表位融合性酵母表達載體示意圖。

圖2為本發明的技術路線示意圖。

圖3與V5融合的TR蛋白在酵母細胞中的表達。

圖4AR在酵母細胞中的表達。

圖5V5抗原表位融合性AR的功能驗證原理。其中各泳道為V5融合性TR在不同克隆酵母細胞中的表達。

圖6V5抗原表位融合性AR功能驗證結果。其中各泳道為V5融合性AR在不同克隆酵母細胞中的表達。

具體實施方式

文中所用到的質粒：

pYESTrp2：購自Invitrogen公司。

pcDNA/TR：購自Clontech公司