[發(fā)明專利]一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協(xié)同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210052838.6
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102533717A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭璞;王杰;盧嬋;楊緒娥
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/10;C12N11/08;C12N11/02;C12P19/14
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協(xié)同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法，具體涉及一種磁性固定化β-葡萄糖苷酶的制備方法，以及該固定化酶在秸稈纖維素水解中的應(yīng)用，屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）又稱纖維二糖酶，是一種能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵的水解酶。它能夠作用于纖維二糖或纖維寡糖，使其水解為葡萄糖分子，也是纖維素酶的成分之一，可以協(xié)同纖維素酶提高木質(zhì)纖維素水解的速度和程度。在纖維素降解、食品風(fēng)味的改善等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。一般認(rèn)為纖維素類物質(zhì)經(jīng)酶促作用生成葡萄糖至少需要三種酶：內(nèi)切葡聚糖酶，外切纖維二糖水解酶和纖維二糖酶（β-葡萄糖苷酶）。內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維二糖酶把纖維素降解成纖維二糖，它再被纖維二糖酶分解成葡萄糖，纖維素酶的重要作用是通過這三種酶協(xié)同進(jìn)行，最后將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，因此在這個過程中纖維二糖酶起到關(guān)鍵作用。而在多數(shù)的纖維素酶組成中纖維二糖酶組分較少，活力低，影響二糖類物質(zhì)分解，成為纖維素酶整個水解的瓶頸。纖維素是葡萄糖以1,4-糖苷鍵結(jié)合的聚合物，為植物細(xì)胞壁的構(gòu)成成分，占植物干重的1/2到1/3。全球一年間由光合作用生產(chǎn)的的纖維素達(dá)1000億噸，是最豐富的可再生資源。將植物纖維應(yīng)用于發(fā)酵食品工業(yè)原料，具有緩減資源短缺的優(yōu)勢，將對人類是一個重大貢獻(xiàn)。因此，開發(fā)優(yōu)化纖維素水解的方法具有良好的應(yīng)用價值。

由于多數(shù)商品纖維素酶液中，β-葡萄糖苷酶活力低，在纖維素酶中額外添加適量的β-葡萄糖苷酶，可以一定程度上提高秸稈纖維素的酶解率。但商品β-葡萄糖苷酶價格昂貴，通過固定化酶能實現(xiàn)其回收利用，因此降低酶的使用成本。雖然國內(nèi)外對固定化β-葡萄糖苷酶研究較多，如采用海藻酸鈉通過吸附法固定β-葡萄糖苷酶（催化學(xué)報，2008，29(10):1021-2026）；采用ACA微膠囊固定β-葡萄糖苷酶（現(xiàn)代化工，2009，29(10):51-54）。但是這些固定化酶是應(yīng)用在均相體系的反應(yīng)中。纖維素酶水解秸桿的產(chǎn)物除了水解得到的糖類外，還有其它固體殘渣，這給固定化酶的回收造成困難。雖然中國專利CN101270352A公布了一種用磁性納米顆粒固定β-葡萄糖苷酶的方法，該法制備納米固定化酶過程較復(fù)雜，酶活回收率不高，且無在秸桿纖維素非均相反應(yīng)體系中的應(yīng)用報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協(xié)同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法，本發(fā)明針對纖維素酶水解秸桿反應(yīng)體系，通過制備磁性固定化酶，實現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的反復(fù)利用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協(xié)同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法。包括：

（1）用殼聚糖、丙酸、PEG400和Fe₃O₄顆粒制備磁性殼聚糖微球，并用戊二醛活化，得到固定化載體；

（2）β-葡萄糖苷酶吸附于磁性殼聚糖微球固定化載體上，得磁性固定化β-葡萄糖苷酶；

（3）磁性固定化β-葡萄糖苷酶協(xié)同纖維素酶水解秸稈纖維素。

該方法制得的磁性固定化β-葡萄糖苷酶在溫度、pH及使用次數(shù)上面表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。將此固定化酶應(yīng)用于水解秸稈，表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用。

以下是本發(fā)明方法的詳細(xì)描述：

固定化載體的制備：

在45~60?mL去離子水體系中，殼聚糖質(zhì)量為0.5~1.0?g，丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%~2.5%，PEG400為40~60?μL，F(xiàn)e₃O₄顆粒質(zhì)量為0.5~1.0?g，將上述組份攪拌均勻，形成透明均一的膠體后，除去氣泡，滴入50-300?mL?2?M的NaOH溶液中，靜置8~12?h，得到殼聚糖磁性微球，過濾后1g殼聚糖磁性微球用20mL?1.5%~3.0%的戊二醛溶液在25℃處理2~4?h，過濾后得到固定化載體；

磁性殼聚糖微球固定化載體吸附β-葡萄糖苷酶：

將0.5~0.8?g固定化載體加入到8~12?mL、pH4.5~5.0的β-葡萄糖苷酶溶液中，酶活為0.6-10?CBIU/mL，于150~200?r/min、20~25℃下震蕩5~15?h，得到磁性固定化β-葡萄糖苷酶。

磁性固定化β-葡萄糖苷酶協(xié)同纖維素酶水解秸稈纖維素：