[發明專利]攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應用

無效

• 申請號: 201210052582.9
• 申請日: 2012-03-02
• 公開（公告）號: CN102578050A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 吳建祥;周雪平;倪躍群;徐毅;劉歡;周文武;饒黎霞;祝增榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明所屬的領域為生物技術領域，尤其是涉及一種攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應用。

背景技術

水稻齒葉矮縮病毒(Rice?ragged?stunt?virus,?RRSV)是上個世紀70年代末發現的一種新病毒，在東南亞、東亞和南亞一些國家局部發生，對水稻生產造成一定影響。目前主要發生流行于我國的廣西、福建、湖南、江西、貴州、云南等地。病株表現濃綠矮縮，葉片扭曲呈鋸齒狀缺刻，在葉背和葉鞘生有細長脈腫。分蘗期前發病不能抽穗，后期發病，抽穗不完全、谷粒不充實等癥狀。發病田塊一般減產10％～20%，嚴重的減產可達80％～100%，是影響水稻產量比較嚴重的病毒病害之一。RRSV為呼腸孤病毒科水稻病毒屬(Oryzavirus)的典型成員，引起水稻齒葉矮縮病。RRSV基因組包括10條雙鏈RNA片段(S1-S10)，其形態結構和基因組雙鏈RNA的電泳圖譜與該科另外兩個屬—植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)和斐濟病毒屬(Fifivirus)的病毒有較大的區別。RRSV具有雙層衣殼，呈二十面體結構，完整病毒粒體的直徑約為65nm，核心顆粒約50nm。電鏡下可觀察到直徑50～66nm或是40nm的病毒粒子分布在感病水稻葉片韌皮細胞的病毒質體(viro-plasm)中；帶毒蟲體內的器官或組織里也可觀察到直徑40～45nm或50～75nm兩類球形結晶狀粒子，聚集或是分散地排列在細胞質的病毒質體中。水稻鋸齒葉矮縮病毒主要由介體昆蟲褐飛虱傳播，病株液汁、種子和土壤均不傳毒。其自然寄主有水稻、蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麥、小麥、燕麥、玉米、甘蔗、稗等10多種。RRSV的介體昆蟲褐飛虱(Nilaparvatalugens)是一種遷飛性昆蟲，其傳播為持久性方式，但不經卵傳播。褐飛虱的若蟲蛻皮但不失毒，病毒在蟲體中的分布以唾液腺中含量最高。介體最小獲毒時間是3小時（h），平均9天(d)。最短的傳毒期是1h，接種后10-36d顯示癥狀，傳毒率大約為40％。幼蟲可能比成蟲的傳毒效率更高，雌蟲和雄蟲，長翅型和短翅型傳毒效率相同。介體傳毒通常具有間歇性傳毒期，可保持1-4周或終生傳毒。不同地理種群的褐飛虱具有相似的傳毒特性。

目前RRSV在我國多個省份流行，已嚴重影響我國的水稻糧食生產，而抗病品種應用是水稻病毒病最經濟、最有效的方法，這就決定迫切需要建立一種RRSV水稻抗性品種的鑒定方法，為抗RRSV的水稻資源的發掘、抗性品種鑒定和品種選育提供技術手段。因為RRSV傳播方式的特殊性，不能用病汁液摩擦接種方式進行接種且不經卵傳播，本發明專利采用在病株或凍存病樣上飼喂的方式獲得攜帶RRSV的褐飛虱，這為水稻抗性品種的鑒定、抗病選育、抗RRSV的特異性單克隆抗體的篩選以及褐飛虱與RRSV的互作研究提供物質和技術支持。且本發明提供的通過飼喂方式使褐飛虱從冷凍葉片上獲得RRSV的方法，解決了患病植株難以長期保存的問題，拓寬了研究的時間，有利于抗病品種的選育、抗RRSV的特異性單克隆抗體的篩選以及褐飛虱與RRSV的互作等研究工作。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法及其應用。

攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱的獲得方法的步驟如下：

1）褐飛虱的獲得

從非水稻齒葉矮縮病毒發生地區的水稻田間捕獲褐飛虱后，在室內用非抗蟲水稻品種的無毒秧苗飼養，飼養溫度為26～30℃，相對濕度為60?%～75?%，光周期為16L：8D；待褐飛虱成蟲交配后單頭蟲單獨產卵，隨機抽取種群中10%的褐飛虱用RT-PCR和dot-ELISA方法分析帶毒情況，保留不帶毒雌蟲的后代并建立室內種群，以后每代隨機抽取種群中10%的褐飛虱用RT-PCR、dot-ELISA方法確定褐飛虱不帶水稻齒葉矮縮病毒，即獲得不攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱；

2）褐飛虱的獲毒

褐飛虱從冷凍保存感病水稻病株中獲毒

用濾紙保濕下1～2齡褐飛虱若蟲饑餓2～3小時；-10～-80℃冰箱中取出冷凍保存的感染水稻齒葉矮縮病毒的水稻病株1～3株，放置溫室或4℃冰箱中解凍1～3小時后移入以尼龍紗布封口的圓形開口塑料容器或燒杯中，然后放入已饑餓2～3小時的20-300只1～2齡褐飛虱若蟲，飼毒1～2天后將存活的褐飛虱移至養蟲的健康水稻苗，飼毒褐飛虱在健康水稻苗上經過約10～15天病毒循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法檢測褐飛虱體內的水稻齒葉矮縮病毒，分析其帶毒率，獲得攜帶水稻齒葉矮縮病毒的褐飛虱；