[發(fā)明專利]提取堆肥宏基因組DNA的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210052027.6
• 申請日: 2012-03-01
• 公開（公告）號: CN102533736A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設計）人: 李季;霍培書;陳雅娟
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發(fā)明涉及一種提取堆肥宏基因組DNA的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用。

背景技術

堆肥本身含有較多的抑制因子，且堆肥過程中產生大量腐植酸，這些物質會對總DNA(宏基因組DNA)的提取產生強烈的影響，很難提取到可以作為PCR擴增模板的總DNA。

反硝化細菌(denitrifying?bacteria)，是硝化和反硝化研究中非常重要的一種細菌。傳統(tǒng)的反硝化細菌篩選方法是使用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)接種，單培養(yǎng)周期就要14天，整個篩選過程一般需要兩周以上，耗時太長，且準確性很差。而且環(huán)境中的微生物99％是不可培養(yǎng)的，傳統(tǒng)的篩選方法大大限制了人們對土壤微生物資源及其基因資源的研究與利用。

對反硝化細菌的研究可有助于堆肥過程中反硝化菌的衍替情況進行研究，進一步了解堆肥過程中硝化和反硝化的過程，有助于更深入地了解堆肥發(fā)生的機理，從而更好地實現(xiàn)對其技術的控制和優(yōu)化。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種提取堆肥宏基因組DNA的方法及其在鑒定反硝化細菌中的應用。

本發(fā)明提供的提取堆肥宏基因組DNA的方法，包括如下步驟：

(1)將堆肥樣品和DNA提取液置于離心管中進行物理裂解；所述物理裂解包括2-4次如下步驟：液氮處理10-20min(如10-15min或15-20min)，然后63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴融化；

(2)在完成步驟(1)的離心管中加入溶菌酶，36-38℃(如36-37℃或37-38℃)水浴25-35min(如25-30min或30-35min)；

(3)在完成步驟(2)的離心管中加入蛋白酶K，36-38℃(如36-37℃或37-38℃)水浴25-35min(如25-30min或30-35min)；

(4)在完成步驟(3)的離心管中加入18-22g/100ml(如18-20g/100ml或20-22g/100ml)的SDS水溶液，63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴100-140min(如100-120min或120-140min)；

(5)將完成步驟(4)的離心管18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)離心13-17min(如13-15min或15-17min)，收集上清液；

(6)在完成步驟(5)的離心管中加入DNA提取液和18-22g/100ml(如18-20g/100ml或20-22g/100ml)的SDS水溶液，63-67℃(如63-65℃或65-67℃)水浴8-12min(如8-10min或10-12min)，然后18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)離心13-17min(如13-15min或15-17min)，收集上清液；

(7)將步驟(5)的上清液和步驟(6)的上清液合并；

(8)將步驟(7)的上清液和酚-氯仿-異戊醇混合液等體積混合，混勻后18-22℃(如18-20℃或20-22℃)、12000-14000g(如12000-13000g或13000-14000g)離心8-12min(如8-10min或10-12min)，收集上清液；所述酚-氯仿-異戊醇混合液是將25體積份苯酚、24體積份氯仿和1體積份異戊醇混合得到的；

(9)將步驟(8)的上清液和異丙醇混勻，18-22℃(如18-20℃或20-22℃)沉淀50-70min(如50-60min或60-70min)，收集沉淀，即為堆肥宏基因組DNA；步驟(8)的上清液和異丙醇的體積比為1∶0.5-0.7(1∶0.5-0.6或1∶0.6-0.7)。

所述步驟(1)中，所述物理裂解可包括3次如下步驟：液氮處理15min，然后65℃水浴融化。

所述步驟(2)中，所述36-38℃水浴25-35min具體可為37℃水浴30min。

所述步驟(3)中，所述36-38℃水浴25-35min具體可為37℃水浴30min。

所述步驟(4)中，所述SDS水溶液的濃度具體可為20g/100ml，所述63-67℃水浴100-140min具體可為65℃水浴120min。

所述步驟(5)中，所述18-22℃、12000-14000g離心13-17min具體可為20℃、13000g離心15min。