[發明專利]中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株有效

申請號：	201210051423.7	申請日：	2012-03-01
公開（公告）號：	CN103710276A	公開（公告）日：	2014-04-09
發明（設計）人：	韓文瑜;馮新;雷連成;宋戰昀;刁昱文;趙紅蕾;高宇	申請（專利權）人：	吉林大學
主分類號：	C12N1/19	分類號：	C12N1/19;A23K1/16;C12R1/84
代理公司：	吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100	代理人：	白冬冬
地址：	130062 吉***	國省代碼：	吉林;22
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摘要：
搜索關鍵詞：	中國組成型畢赤酵母陽性表達菌株
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域。?

背景技術

鱟是一種極其珍貴的海洋無脊椎動物，也是海洋動物界現存的“活化石”，其經濟價值和科研價值很高。鱟缺乏獲得性免疫系統，在抵抗病原侵襲的過程中形成了多種天然防御系統，在這些防御系統中，鱟素(tachyplesin)發揮了主要的抗病原作用。鱟素是一類存在于鱟血細胞中的具有抗菌活性的陽離子多肽，它的發現被醫學界稱為“抗生素”研究的一個里程碑，是后抗生素時代到來的標致。自1988年日本學者Nakamura?T從東方鱟中分離提取鱟素以來，鱟素的研究引起了人們的廣泛關注，現己知道，鱟素是一種2.3Ku的陽離子抗菌肽，由17個氨基酸組成，形成2個二硫鍵，其羧基端帶有1個α精氨酰胺，1988年這種肽被命名為Tachyplesin?I。研究表明，鱟素具有以下抗菌特性：(1)殺菌活力高，致死濃度均在μmol/L級；(2)作用迅速，往往在幾秒或幾分鐘內可將99％以上的病原殺滅；(3)對真核生物細胞無毒性；(4)活性穩定，比較耐熱，100℃處理30min不喪失其抗菌活性；(5)在高鹽環境下同樣具有抗菌活性，這是海洋抗菌肽的一個重要特征。鱟素的抗微生物作用己遠遠超過目前抗生素藥物的作用范疇，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌及囊膜病毒均能產生有效的殺傷作用，且沒有耐藥性問題，因此應用前景十分誘人。?

發明內容

本發明的目的是提供一種中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株。?

本發明菌株為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC?No.5462。?

本發明菌劑，其活性成分為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，CGMCC?No.5462。?

本發明中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株在飼料添加劑中的應用。?

本發明作為飼料添加劑的優勢在于：一是高效綠色，表達的抗菌肽可具有廣譜的抗細菌、抗病毒、抗霉菌等廣泛的生物學效應，且不產生耐藥性，無殘留；二是補充蛋白，酵母菌本身是高蛋白的飼料添加劑和胃腸道正常菌群的一部分，可以同時起調節胃腸菌群和補充營養的作用。用它表達的藥用蛋白不需進行大量的宿主安全性實驗，外源蛋白的分泌型表達使其純化更加簡便。三是兼顧抗生素，酵母菌由于對抗生素和抗菌藥具有抗性，解決了目?前微生態制劑不能同時應用抗生素的弊端。而且，己報道陽離子抗菌肽與傳統抗生素聯合用藥時會產生協同作用。因此，基因工程抗菌肽酵母制劑是一種適合在畜牧業推廣應用的、有益于肉類產品質量和安全的新型飼料添加劑，具有廣闊的應用開發前景。?

本發明應用的兩個關鍵點在于：一是抗菌肽的高效表達。抗菌肽是動物的體內成分之一，是一類小分子短肽，具有安全、無殘留、無毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制劑，無任何毒副作用，對多種病毒和細菌性疾病均有顯著的預防效果，同時具有改善畜禽生產生長性能、減少機體發病的作用，能有效替代飼用抗生素或化學合成藥物的使用，具有良好的推廣應用前景。二是酵母菌體蛋白。發酵產物富含生物活性蛋白、優質的維生素及促生長因子，可顯著提高機體免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，誘食效果佳，可顯著提高畜禽出欄重。?

附圖說明

圖1是溫度和糖濃度對表達上清影響的三維響應面圖；?

圖2是溫度和pH值對表達上清影響的三維響應面圖；?

圖3是糖濃度和pH值對表達上清影響的三維響應面圖；?

圖4是自控罐發酵操作各因素曲線圖；?

圖5是搖瓶和發酵罐發酵產物Tricine-Glycerol-SDS-PAGE結果比較；?

圖6是薄層掃描比較分析結果；?

圖7是表達上清凍干粉Tricine-SDS-PAGE鑒定；?

圖8是表達上清凍干粉；?

圖9是表達上清的質譜分析結果；?

圖10是鱟素高效液相色譜標準曲線；?

圖11是高效液相色譜分析TP?I表達上清。?