[發(fā)明專利]一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210051213.8
• 申請(qǐng)日: 2012-03-01
• 公開（公告）號(hào): CN102600468A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚偉;蔣正東;朱智勇;郭志軍;蘇波;鐘建琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江天元生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/39
• 分類號(hào): A61K39/39;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 陳繼亮

1.一種含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，其特征是：該方法步驟如下：

(1)、病毒接種與培養(yǎng)：于雞胚尿囊腔接種經(jīng)稀釋的禽流感工作種子批毒種，置33～35℃培養(yǎng)48～72小時(shí)；

(2)、病毒收獲：篩選活雞胚，置2～8℃一定時(shí)間冷胚后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，澄清過濾后逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定；

(3)、病毒滅活：病毒滅活前取樣測(cè)定蛋白含量，控制蛋白質(zhì)含量在不超過5mg/ml的范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活，收獲的含有病毒的尿囊液加入終濃度為200μg/ml的甲醛，置2-8℃滅活15～24小時(shí)，滅活結(jié)束分別對(duì)每個(gè)病毒滅活容器采樣，進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定；

(4)病毒收獲液濃縮：滅活后的收獲液經(jīng)澄清處理，然后用截留分子量為1000KD的超濾膜超濾濃縮不超過10倍；

(5)、病毒純化：

(5.1)蔗糖速率區(qū)帶離心：在靜止時(shí)以不超過離心腔容積50％的量泵入50～60％的蔗糖溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)器轉(zhuǎn)速至35000r/min～40000r/min，連續(xù)泵入病毒液，進(jìn)樣完畢，泵入緩沖液后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至0r/min，待機(jī)器停穩(wěn)，在280nm波長監(jiān)測(cè)下，收集病毒峰；

(5.2)柱層析：用Sephrose-4FF凝膠柱色譜法純化，上樣量不超過凝膠體積的8％，洗脫液為0.01mol/L的PBS，pH7.2，上樣及洗脫線性流速為5～6mm/min，檢測(cè)波長為280nm，收集第一峰，純化后取樣進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定；

(6)、病毒裂解：純化后的病毒液加入終濃度為0.3～0.5％Triton?X-100及去氧膽酸鈉，混勻后置20～30℃下作用90～120分鐘，然后梯度離心2小時(shí)，在280nm波長監(jiān)測(cè)下收集第一峰；

(7)、除糖除裂解劑：將離心后的裂解物用無菌0.01M?pH7.2PBS溶液進(jìn)行超濾濃縮，以去除蔗糖并進(jìn)一步去除裂解劑，最終濃縮至合適液量，取樣檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素含量和微生物限度，控制細(xì)菌內(nèi)毒素不高于50EU/ml，微生物限度檢測(cè)要求不高于10cfu/ml；

(8)、除菌過濾：純化后的裂解物經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾即為單價(jià)原液，單價(jià)原液應(yīng)置于2-8℃保存。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含MF59佐劑禽流感病毒裂解疫苗的制備工藝，其特征是：半成品配制：根據(jù)所配制的半成品總量計(jì)算原液用量，使血凝素含量為30μg/ml，按50％的量加入MF59佐劑，再加入Buffer溶液，混勻后經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾，即為半成品。