[發(fā)明專利]GhPAO基因、其編碼蛋白及在植物抗黃萎病中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210050058.8
• 申請日: 2012-02-29
• 公開（公告）號: CN102559625A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設計）人: 馬峙英;默輝娟;孫艷香;王省芬;張艷;張桂寅
• 申請（專利權）人: 河北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/63;C12N5/10;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程領域，特別是涉及GhPAO基因、其編碼蛋白及在植物抗黃萎病中的應用。

背景技術

黃萎病被稱為“棉花癌癥”，黃萎病的發(fā)生導致棉花纖維品質(zhì)和產(chǎn)量嚴重下降。全世界每年造成的皮棉產(chǎn)量損失約占皮棉產(chǎn)量的10％-20％，嚴重發(fā)病的年份可以達到25％-30％。因此，黃萎病已成為棉花生產(chǎn)中亟待解決的問題。到目前為止尚未找到徹底防治棉花黃萎病的辦法。利用抗病品種進行黃萎病的防治受到育種周期長和抗黃萎病資源匱乏等因素的限制，而轉Bt基因棉在棉花生產(chǎn)上的成功應用，使得利用基因工程手段改良品種的黃萎病抗性成為可能。

目前，已從棉花上克隆了一些抗病相關基因，這些基因的克隆為棉花抗病基因工程的研究奠定了良好的基礎。最近，Parkhi等將NPRl基因?qū)朊藁ê螅D基因植株表現(xiàn)為一種廣譜性抗病，不僅可以抗多種真菌病害，還同時對線蟲病害有一定的抗性。盡管前人從棉花中克隆了大量與抗病相關的基因，但有關多胺代謝途徑中多胺氧化酶基因PAO的克隆及功能分析鮮有報道。

多胺對DNA的穩(wěn)定、RNA和蛋白的合成、細胞膜的穩(wěn)定、離子通道的調(diào)控、氧自由基的清除起重要的作用，參與增殖、分化、形態(tài)建成、種子的休眠和萌發(fā)、塊莖形成、開花誘導、果實的生長和成熟、胚胎的形成、衰老等細胞進程。多胺代謝在植物響應各種生物和非生物脅迫時發(fā)生重大變化，在非親和性的植物-病原體互作中，多胺通過與酚類化合物共軛，參與寄主植物果膠多糖的合成、木質(zhì)素的沉積、細胞pH的調(diào)控。多胺氧化酶(PAO)通過催化亞精胺和精胺的含氧分解代謝產(chǎn)生過氧化氫(H₂O₂)，H₂O₂可通過結構防御、信號分子或作為直接的抗菌化合物提高寄主植物的抗性。

有研究表明，在煙草中過表達玉米PAO基因能有效防御假單胞菌和卵菌病原體的侵染，并將胞內(nèi)精胺分泌到胞外，維持了多胺的動態(tài)平衡，顯著提高了基于細胞壁的抗性標記基因的表達；外源添加亞精胺后，過表達玉米PAO的煙草，能產(chǎn)生較多的H₂O₂，并誘發(fā)過氧化物酶(POD)活性的提高，啟動多胺補償機制，維持多胺的動態(tài)平衡，清除過剩的活性氧，增強煙草的抗逆性。

本實驗室以篩選黃萎病菌誘導陸地棉抗病品種“冀棉20”的SSH文庫得到的差異片段為種子序列，通過電子克隆和反轉錄鏈式聚合酶反應(reverse?transcription?PCR，RT-PCR)得到抗黃萎病相關基因多胺氧化酶基因GhPAO全長序列信息，通過構建真核超表達載體并轉化模式植物擬南芥，從分子生物學、細胞學、生理生化和表型水平，證明GhPAO基因具有一定的抗黃萎病作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種GhPAO基因及其編碼蛋白。

本發(fā)明的另一目的是提供上述GhPAO基因在植物抗黃萎病中的應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種GhPAO蛋白，其具有SEQ?IDNo.2所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如在非活性區(qū)段，將第394位的纈氨酸(Val)替換為亮氨酸(Leu)，或是將第131位的Cysteine半胱氨酸(Cys)缺失，或是在464位添加絲氨酸(Ser)均不會影響蛋白的功能。

本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。該基因是通過基因工程方法獲取。

本發(fā)明還提供含有棉花GhPAO基因的載體及含有該載體的宿主細胞。

本發(fā)明還提供含有棉花GhPAO基因的轉化植物細胞。

本發(fā)明進一步提供棉花GhPAO基因在植物抗黃萎病中的應用。優(yōu)選地，所述植物為棉花或擬南芥。

具體地，本發(fā)明是以黃萎病菌誘導下陸地棉抗病品種“冀棉20”的SSH文庫得到的差異片段為種子序列，通過電子克隆和反轉錄鏈式聚合酶反應(reverse?transcription?PCR，RT-PCR)并經(jīng)過常規(guī)克隆測序方法得到GhPAO基因全長序列信息，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

借由上述技術方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明提供了棉花GhPAO基因及其編碼的蛋白，其核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。

(2)利用本發(fā)明提供的超表達GhPAO基因的轉基因擬南芥，其黃萎病抗性顯著提高。