[發明專利]阿苯達唑–2–氨基砜殘留檢測單克隆抗體及制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210049837.6
• 申請日: 2012-02-29
• 公開（公告）號: CN103288964A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 袁宗輝;蔣能輝;彭大鵬;王玉蓮;黃玲利;陳冬梅;陶燕飛;戴夢紅;劉振利
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C12N5/20;G01N33/577;G01N33/543;C12R1/91
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于獸藥殘留分析和免疫學技術領域。具體涉及一種能識別阿苯達唑殘留標示物阿苯達唑-2-氨基砜的單克隆抗體，同時還涉及一種能識別阿苯達唑殘留標示物阿苯達唑-2-氨基砜的單克隆抗體的制備方法，還涉及一種能識別阿苯達唑殘留標示物阿苯達唑-2-氨基砜的單克隆抗體的用途。

背景技術

阿苯達唑是獸醫臨床上廣泛使用的苯并咪唑類驅蟲藥，具有廣譜、高效、低毒的特點。在牛羊等反芻動物使用較多，對常見的線蟲、吸蟲和絳蟲均有驅殺效力。阿苯達唑給藥后通過肝臟或胃腸道粘膜細胞的首過效應迅速代謝為阿苯達唑亞砜和阿苯達唑砜，最終轉化為阿苯達唑-2-氨基砜。阿苯達唑原形在血漿中很難檢測到，但其代謝物廣泛分布到體內組織與體液，以肝臟中最多，其次為腎臟。阿苯達唑及其代謝物在動物組織殘留具有毒理學意義，實驗研究證實阿苯達唑或其代謝物的蓄積具有致畸和胚胎毒性等毒理學危險；此外，阿苯達唑治療人的寄生蟲病時具有潛在發生不良反應的危險，長期用藥更易發生遲發的嚴重不良反應，涉及血液系統、消化系統、皮膚病、神經系統等，尤其是遲發的以腦炎綜合癥為主的神經系統疾病，有潛在致死、致殘的危險。阿苯達唑及其代謝物的殘留對寄生蟲耐藥性產生也有促進作用。

各國已將阿苯達唑列為食品殘留重點監控對象，規定了其最大殘留限量(MRL)和殘留標示物(MR)。中華人民共和國農業部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》對阿苯達唑在動物組織中殘留也制定了最高殘留限量。目前有關阿苯達唑及其代謝物的殘留檢測方法主要包括生物學鑒定法、免疫學分析法和儀器分析法等，其中液相色譜法(HPLC)是可食性動物產品中阿苯達唑及其代謝物殘留檢測應用最廣泛的方法。儀器分析方法雖然靈敏、準確、分離度高并且可進行多殘留檢測的定性、定量研究，但是需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業操作員。如果采用儀器分析法進行大批量樣品的檢測，其成本將非常高；而且在目前的國家檢測機構中大部分只有省市級才配備有精密的分析儀器。因此需要建立一個從篩選到確證的檢測體系，有關阿苯達唑的殘留確證方法已經相對完善，但可用于大批量樣品初篩的檢測方法研究較少。微生物鑒定法和免疫分析法是殘留檢測篩選的常用方法。阿苯達唑等苯并咪唑類藥物具有驅蟲的活性，基于寄生蟲體外培養技術發展起來的生物學鑒定法在阿苯達唑等藥物的殘留檢測中已有使用，但是存在特異性差、靈敏度低和結果判定困難等固有缺陷。

酶聯免疫分析法(ELISA)是將抗原抗體反應與現代測試手段結合的超微量分析法，集現代測試方法的高靈敏度和抗原-抗體反應的強特異性于一體。相對于儀器分析法，免疫學分析法具有操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強、檢測費用低等優點，適用于大批量樣品的初篩。但到目前為止，只有數篇直接或相關的文獻報道了阿苯達唑的免疫學檢測方法。Johnsson等(2002)將阿苯達唑與人血清蛋白結合制備完全抗原，免疫羊后得到對阿苯達唑等8種苯并咪唑類藥物有交叉反應的多克隆抗體。Brandon等(1994)利用苯并咪唑類藥物大多數都具有氨基甲酸甲酯支鏈的特點，以5(6)-羧戊基-硫-苯并咪唑氨基甲酸甲酯半抗原制備單克隆抗體，并建立了間接競爭ELISA方法，最低檢測限可達10μg/kg。獲得的抗體可以識別阿苯達唑、阿苯達唑亞砜、阿苯達唑砜、芬苯達唑等含有氨基甲酸甲酯支鏈的苯并咪唑類藥物。以上報道的ELISA方法都未能形成商品化的試劑盒，這是因為其制備的抗體存在缺陷，不能識別阿苯達唑--2-氨基砜。阿苯達唑--2-氨基砜是阿苯達唑殘留標示物的重要組成部分，其在組織中的殘留量與阿苯達唑的總殘留量存在比例關系(約為20％)，美國甚至單獨以它作為殘留標示物檢測阿苯達唑的殘留。此外，Brandon等(1994；1998)認為將肝臟組織經簡單的純水或檸檬酸溶液(pH?3.0)一步提取后即可用于ELISA檢測，但是從其報道的結果來看，回收率在14％～129％之間，普遍偏低于檢測要求(60％～120％)。可見，研究一種基于阿苯達唑--2-氨基砜抗體的ELISA快速篩選方法對大批量樣品中阿苯達唑殘留檢測具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術不能識別阿苯達唑殘留標示物阿苯達-2-氨基砜的缺陷，提供了一種能特異性識別阿苯達唑殘留標示物阿苯達-2-氨基砜的單克隆抗體。該抗體除與阿苯達唑砜有68％的交叉反應外，與其他苯并咪唑類藥物均無交叉反應。