[發明專利]多氧霉素與尼可霉素雜合抗生素及其制備方法

無效

• 申請號: 201210049728.4
• 申請日: 2012-02-29
• 公開（公告）號: CN102603867A
• 公開（公告）日: 2012-07-25
• 發明（設計）人: 陳文青;鄧子新;翟李鵬;程放
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C07K5/083
• 分類號: C07K5/083;C12P21/02;C12N1/21;A61P31/10;A01P3/00;C12R1/465
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

技術領域

本發明涉及利用合成生物學策略對多氧霉素工業菌株進行代謝通路改造而生產雜合抗生素，具體而言，涉及多氧霉素與尼可霉素雜合抗生素及其制備方法，屬于生物制藥領域。

背景技術

近年來，一方面由于廣譜抗生素、免疫抑制劑、細胞毒藥物的廣泛應用，導管介入、器官移植等治療手段的普及以及惡性腫瘤、艾滋病等臨床嚴重疾病的發生率不斷上升，深部真菌感染病例日益增多；另一方面，臨床抗真菌藥物的長期運用，真菌耐藥性也越來越嚴重。因此目前亟待需要研發出新型的抗真菌藥物來應對日益嚴重的深部真菌感染問題。

作為幾丁質合成酶的特異性抑制劑，多氧霉素與尼可霉素不僅具有廣譜的抗真菌活性，并且對動植物毒性較低。但由于體外活性很難轉化為體內活性，這兩個抗生素并沒有在臨床上得到廣泛應用。

如下結構式所示，多氧霉素與尼可霉素在化學結構上具有很大的相似性。它們都是由一個核苷骨架與一個或兩個肽基組合而成。多氧霉素是尿嘧啶或其5’位置被甲基、羥甲基或羧基取代的尿嘧啶，而尼可霉素核苷骨架的堿基部分也可以是尿嘧啶，因而兩者都可以使用尿嘧啶作為核苷骨架的堿基部分。

多氧霉素與尼可霉素結構上也有很多不同點。就核苷骨架的堿基部分來說，尼可霉素除了可以使用尿嘧啶外還可以使用4-甲酰-4-咪唑-2-酮。對肽基部分來說，兩者結構上的不同點更為明顯。多氧霉素在R1位置的肽基可以是聚肟酸(POIA)，而尼可霉素在該位置可以是谷氨酸；多氧霉素的另一個肽基是氨甲酰多氧聚草氨酸(CPOAA)，尼可霉素的另一個肽基是羥基吡啶同型蘇氨酸(HPHT)。

由于尼可霉素與多氧霉素有相同的核苷骨架，因而它們的負責核苷骨架生物合成的蛋白有較高的同源性。與核苷骨架生物合成相關的蛋白包括PolA、PolD、PolH、PolI、PolJ、Polk都在尼可霉素生物合成酶系中有同源性較高的蛋白。此外，負責多氧霉素核苷骨架與肽基的組裝的PolG、負責多氧霉素運輸的PolQ1和PolQ2、負責多氧霉素生物合成調控的PolR也都有同源的尼可霉素生物合成蛋白相對應。

多氧霉素與尼可霉素化學結構上有一定的相似性，但有所不同；而且兩者的生物合成基因簇中相關基因同源性也較高。這也就意味著一方面可以基于兩個抗生素結構上的不同點設計一系列雜合抗生素，另一方面由于化學結構相近，基因同源性較高，因而生物合成蛋白對于底物的選擇也可能有一定的寬容性。因而可以通過對多氧霉素與尼可霉素的生物合成基因簇進行改造而產生雜合抗生素。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供多氧霉素與尼可霉素的四個雜合抗生素Polyoxin?N、Nikkoxin?B、Nikkoxin?C、Nikkoxin?D，其結構式如下所示。

制備上述雜合抗生素的方法，包括以下步驟：

1)重組菌株ZLP2、ZLP3和ZLP6的構建

將質粒pJTU5701/ΔnikB通過接合轉移入多氧霉素工業菌株polA基因突變株SA1，通過apramycin抗性篩選，得到重組菌株ZLP2；

將質粒pJTU5701/ΔnikB通過接合轉移入多氧霉素工業菌株polA和polF基因雙突變株SA2，通過apramycin抗性篩選，得到重組菌株ZLP3；

將質粒pJTU5701/ΔnikBΔnikQ通過接合轉移入多氧霉素工業菌株polA和polF基因雙突變株SA2，通過apramycin抗性篩選，得到重組菌株ZLP6；

2)重組菌株ZLP2、ZLP3和ZLP6的發酵及雜合抗生素提取和純化

將重組菌株ZLP2、ZLP3或ZLP6直接進行發酵培養，發酵液用草酸調節pH值至3.0，過濾后用強酸性陽離子交換樹脂吸附，用氨水洗脫，選擇性收集組分，旋轉蒸發濃縮；用HPLC進行檢測，再經制備型HPLC得到雜合抗生素純品。